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体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)是利用卵母细胞胞质中的重编程物质对高度分化体细胞核进行重编程作用使其恢复全能性并发育为新个体的技术。迄今为止,应用体细胞核移植技术已相继诞生牛、小鼠、猪、兔等10余种克隆动物,但其较低的克隆率限制了它的发展。表观遗传药物,例如组蛋白去乙酰基酶抑制剂,可改善表观遗传修饰的异常现象,促进体细胞核移植重构胚的重编程,从而促进胚胎发育。Psammaplin A(PsA),为一种新型的组蛋白去乙酰基酶抑制剂,其对牛SCNT胚胎发育影响作用,并未见报道。因此本研究利用免疫组织化学及荧光定量PCR等技术,分析PsA对牛孤雌胚胎卵裂率、囊胚率、早期胚胎发育关键基因表达及组蛋白标记表达分布的影响,确定PsA的试验浓度和时间。以此为基础,研究PSA对牛早期克隆胚胎发育的影响。结果如下:1.PsA对牛孤雌胚胎卵裂率和囊胚率的影响:6 h 5μM和10μM、12 h5μM和10μM的PsA处理对牛孤雌胚胎的卵裂率的影响不显著,卵裂率在62%-68%之间;12 h PsA处理极显著降低了牛孤雌胚胎的囊胚率,6 h 10μM显著降低了胚胎的囊胚率,而6 h 5μM囊胚率增加但差异不显著。这个结果表明,随着PsA浓度的增加和处理时间的延长,牛孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率降低。2.PsA处理对牛孤雌胚胎基因表达的影响:PsA处理显著抑制了HDAC1、DNMT1的相对表达水平;对于多能基因Nanog,与对照组相比,实验组6 h 10μM的相对表达量增加,6 h 5μM和12 h 5μM的相对表达量降低但均差异不显著,12h 10μM组的表达显著降低;与对照组相比,PsA处理极显著降低了SOD的表达水平,并降低了BCL的表达水平。这个结果表明,PsA处理对HDAC1和DNMT1的表达具有明显抑制作用,增加了胚胎的氧化和凋亡。综合发育率结果,我们挑选的PsA工作浓度和时间为10μM 6 h。3.PsA处理对牛孤雌胚胎H3K9me3和H3K9ac表达的影响:PsA处理组的牛孤雌胚胎4cell和囊胚的H3K9ac的相对表达量极显著增加,而H3K9me3的相对表达量显著降低。4.PsA对牛SCNT胚胎卵裂率和囊胚率的影响:与SCNT组相比,PsA处理升高了SCNT胚胎的卵裂率和囊胚率,卵裂率提高了6.47%,囊胚率提高了1.15%。结果表明,PsA处理能够促进SCNT胚胎的发育。5.PsA处理对牛SCNT胚胎基因表达的影响:与SCNT组相比,PsA处理明显抑制了HDAC1的表达,DNMT1的表达略有升高但差异不显著;与SCNT组相比,PsA处理降低了SOD的表达,升高了Nanog的表达,增加了BCL的表达,但差异不显著。与IVF组相比,SCNT组HDAC1和DNMT1的表达的表达增加,BCL和SOD表达升高,Nanog表达降低。结果表明,PsA处理对SCNT胚胎HDAC1的表达具有显著抑制作用,促进了多能基因Nanog的表达,抑制了细胞凋亡。6.PsA处理对牛SCNT胚胎H3K9me3和H3K9ac表达的影响:与SCNT和IVF组相比,PsA处理上调了H3K9ac表达,下调了H3K9me3的表达,SCNT和IVF两组间差异不显著。这一结果说明PsA处理可诱导牛SCNT胚胎的染色质重塑,缓和转录抑制,并有助于重构胚的重新编程。总之,PsA处理抑制了HDAC1的表达,促进了多能基因Nanog的表达,上调了H3K9ac表达,下调了H3K9me3的表达,对牛SCNT胚胎的发育起到了促进作用,并有助于核的重编程,这为提高克隆效率奠定了理论基础。