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目的细胞分裂周期蛋白14A(Cell division cycle 14A,Cdc14A)是真核细胞生物中广泛表达的一类特殊的高度保守的双重特异性磷酸酶,存在于多种生物体中,在真核细胞中发挥稳定生物学作用,参与有丝分裂、胞质分裂、减数分裂、DNA损伤修复等生理、病理过程。细胞分裂周期25蛋白家族(Cell division cycle 25,Cdc25)包括三种磷酸酶,分别是Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C,另外现已证明Cdc25B是进入有丝分裂的必要条件。对于裂殖酵母的研究表明:Cdc14在进入细胞分裂期能迅速降解有丝分裂的诱导子Cdc25,Cdc14通过下调Cdc25的活性以确保有丝分裂的Cdk复合物的迅速失活从而退出有丝分裂。我们前期的研究已证实小鼠一细胞期受精卵有Cdc14A的表达,并且在G2期Cdc14A表达最多,M期Cdc14A表达量下降。对Cdc14A的定位研究显示:Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G1、S和G2期定位于细胞的核仁,在M期Cdc14A从核中释放到细胞质。对Cdc25B的定位研究显示:Cdc25B在小鼠一细胞期受精卵中G1、S期位于细胞质,在G2期进入细胞核。另外我们通过构建Cdc14A-WT(野生型,有活性)和Cdc14A-C278S(PD,突变型,无活性)证实了过表达Cdc14A-WT,小鼠一细胞期受精卵延迟进入M期;过表达Cdc14A-C278S对小鼠一细胞期受精卵G2/M期过渡没有影响。并且我们前期的研究也表明小鼠一细胞期受精卵中Cdc14A和Cdc25B可能存在相互作用,相互作用的具体位点可能是Cdc25B-S15,而不是Cdc25B-S186。综合上述资料,我们推测在小鼠一细胞期受精卵的G2/M期转换时Cdc14A和Cdc25B共同定位于细胞核,Cdc14A和Cdc25B结合使Cdc25B去磷酸化失去活性从而无法激活MPF,因而受精卵停止分裂,阻滞于G2期。为了验证上述推测的准确与否,我们以小鼠一细胞期受精卵作为研究目标,通过敲低Cdc14A的表达,以观察它们对小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换的影响;利用间接免疫荧光实验观察Cdc14A和Cdc25B的共定位;以及免疫共沉淀实验确定Cdc14A与Cdc25B是否存在相互作用以及具体的作用位点。方法:1.小鼠进行超排卵处理并集齐G1、S、G2、M四个时期的小鼠一细胞期受精卵;2.显微注射Cdc14A的反义寡核苷酸(MO),并观察其对受精卵发育的影响,RT-PCR以及Western Blotting实验验证干涉效能;3.构建荧光表达质粒p CDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry,p EGFP-Cdc25B-S15A,p EGFP-Cdc25B-S15D;4.间接免疫荧光观察Cdc14A与Cdc25B的亚细胞定位;5.免疫共沉淀实验确定Cdc14A与Cdc25B是否存在相互作用以及具体的作用位点。结果:1.Cdc14A的反义寡核苷酸(MO)注射组和对照组(未注射组和TE buffer注射组)相比,Cdc14A-MO注射组在hCG注射后26h-26.5h开始出现卵裂,hCG注射后28h,受精卵的卵裂率是58.3%,hCG注射后29h,受精卵的卵裂率是92.4%对照组在hCG注射后28h-28.5h开始出现卵裂,卵裂率分别为21.7%、23.4%,在hCG注射后29h,卵裂率分别为53.6%、55.3%,在hCG注射后31h,卵裂率分别为93.5%、91.4%,对照组间卵裂率无差异(P>0.05)。2.间接免疫荧光观察Cdc14A与Cdc25B的定位,在G1、S、G2期Cdc14A定位细胞核,而Cdc25B在G1、S、早G2期定位于细胞质,二者在晚G2期共定位于细胞核。3.免疫共沉淀实验显示:Cdc25B可以与Cdc14A-C278S结合;Cdc14A可以与Cdc25B-WT和Cdc25B-S15D结合,而当Cdc25B的第15位的丝氨酸(Ser)突变为丙氨酸(Ala)时,Cdc14A不能和Cdc25B-S15A结合。结论:1.敲低Cdc14A后,小鼠一细胞期受精卵加速进入M期,Cdc14A是小鼠受精卵早期发育的一个负性调控因子。2.Cdc14A和Cdc25B可相互结合即存在相互作用。3.Cdc25B的第15位丝氨酸是Cdc14A与Cdc25B的结合位点。Cdc14A可以与Cdc25B-WT和具有模拟磷酸化作用的Cdc25B-S15D结合,而不与不能磷酸化的Cdc25B-S15A结合。