目的:皮肤创面愈合是一个复杂的、进化保守的、动态的生物学过程,其目的是恢复皮肤组织的解剖完整性和生理功能。这一过程涉及多种类型细胞协同作用,并由多种不同的细胞分泌因子参与调控。角质形成细胞是影响表皮内环境平衡和免疫防御的关键因素。其在创伤初期和皮肤屏障功能恢复中有重要意义。临床应用已经证明人羊膜组织显著促进创面愈合过程。因其极低的免疫原性、明晰的组成成分以及简单的伦理问题,引起广泛的应用与研究。人羊膜干细胞包括人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stromal cells,hAMSCs)和人羊膜上皮干细胞构成(human amniotic epithelial cells,hAECs)。研究表明,hAECs条件培养基(conditioned medium of hAECs,hAECs-CM)可以调节创面炎症并促进新生血管形成,从而加速糖尿病患者创面愈合。它还通过促进角质形成细胞的迁移和增殖来促进伤口愈合。然而,hAECs在体外培养较困难,在传代培养过程中形态容易发生改变。而细胞疗法需要从单个细胞系中扩增数十亿个细胞用于多种给药方式,还需要防止微嵌合现象和潜在的免疫反应。研究表明hAECs持续扩增,会导致其分化潜能、表面标志物的表达、抑制T细胞增殖能力和免疫抑制因子分泌物质均发生明显改变。综上所述,hAECs稳定产出大量的条件培养基和临床产品开发推广有许多困难和潜在危险。因此,我们意在寻找出可以有效替代的细胞来源。我们早期的研究表明,羊膜间充质干细胞促进大鼠皮肤创面愈合。我们拟用人羊膜间充质干细胞条件培养基(conditioned medium of hAMSCs,hAMSCs-CM)加速创伤愈合并研究其机制,作为hAECs临床产品开发的替代细胞。研究内容包括:1)比较hAMSCs-CM和hAECs-CM两种条件培养基对角质形成细胞生物学作用的差异。2)利用小鼠皮肤全层损伤模型研究hAMSCs-CM对于皮肤创面愈合速率的影响。3)通过Label-free MS分析技术鉴定两种细胞的外分泌蛋白组并利用生物信息学分析对比两种细胞外分泌蛋白组的差异。4)基于生物信息学结果筛选hAMSCs对创伤愈合有积极作用的外分泌蛋白。5)深入研究目标蛋白(LOXL2)促进创伤愈合的能力和其作用机制。研究方法:一、hAMSCs-CM对角质形成细胞生物学及创伤愈合速率的影响研究1、酶解法提取羊膜干细胞hAMSCs和hAECs,并通过流式细胞技术、细胞免疫荧光技术和多项分化潜能进行鉴定。2、酶解法提取人表皮角质形成细胞,通过免疫荧光技术和高钙培养分化进行鉴定。3、用Epilife无血清培养基分别培养羊膜干细胞并收集条件培养基以备后续实验。hAECs作为阳性对照。4、通过细胞划痕实验评估两种羊膜干细胞条件培养基对角质形成细胞迁移的情况的影响。5、MTS试验和流式细胞周期技术评估角质形成细胞增殖变化情况。6、通过real-time PCR和Western Blot检测细胞分化指标评估两种条件培养基对角质形成细胞分化情况的影响。7、通过C57/BL小鼠背部皮肤全切创伤模型,探讨hAMSCs-CM对创面愈合速率的影响。二、hAMSCs和hAECs外分泌蛋白组的鉴定和分析1、利用Label-Free质谱分析技术,对hAMSCs-CM和hAECs-CM中所含蛋白质进行鉴定。2、通过生物信息学分析,筛选出与创伤愈合相关的差异表达的旁分泌蛋白。3、通过ELISA试验验证候选蛋白在条件培养基中的表达情况。三、LOXL2影响创伤愈合以及其机制研究1、通过划痕实验评估候选LOXL2、LGALS1和CTHRC1对角质形成细胞迁移情况。2、通过real-time PCR和Western Blot检测细胞分化指标评估LOXL2对角质形成细胞分化的影响;MTS试验评估LOXL2对角质形成细胞增殖的影响。3、通过划痕实验检测LOXL2缺失的hAMSCs-CM对角质形成细胞迁移的影响。4、通过C57/BL小鼠背部皮肤全切创伤模型,探讨LOXL2对创面愈合速率的影响。5、根据KEGG分析筛选出可能起作用的通路。6、利用JNK抑制剂评估其对角质形成细胞迁移、分化的作用。7、通过Western Blot检测LOXL2处理后JNK,p-JNK,p-YAP1的变化情况。结果:一、hAMSCs-CM促进角质形成细胞迁移加速创伤愈合1、原代提取得到hAMSCs成纤维样、鱼群状分布;hAECs成鹅卵石状。羊膜干细胞两种细胞均可向成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞分化。流式细胞技术鉴定表面标记物CD73(+)、CD45(-)、CD31(-)、CD105(+)、CD44(+)、CD34(-);hAECs:CD90(+)、CD29(+)、SSEA-3(-)、SSEA-4(+)、EP-CAM(50%+)、HLA-DR(-)以上符合羊膜干细胞特性。2、与正常培养体系相比,hAECs-CM明显促进角质形成细胞向划痕区域迁移,而hAMSCs-CM相较稍弱;hAMSCs-CM明显抑制角质形成细胞增殖,且hAECs-CM抑增殖能力较弱;hAMSCs-CM和hAECs-CM均可使分化指标明显下调,二者没有明显差异。3、体内实验表明,与PBS组相比,hAMSCs-CM可有效加速创面愈合的速度。二、hAMSCs高表达外分泌蛋白LOXL2、CTHRC1和LGALS1可能是促进创伤愈合的关键因子1、通过Label-free质谱分析技术鉴定到hAMSCs-CM有84个蛋白表达量较高,70个蛋白表达量较低。2、结合差异表达蛋白聚类分析,筛选出hAMSCs高表达的与皮肤生长发育和创伤愈合等功能相关的潜在蛋白CTHRC1,LOXL2和LGALS1。3、ELISA验证蛋白CTHRC1,LOXL2和LGALS1在hAMSCs-CM明显高于hAECs-CM。三、LOXL2通过激活JNK磷酸化促进角质形成细胞迁移、分化加速再创伤愈合1、LOXL2可以明显加速角质形成细胞向划痕区域迁移。2、LOXL2缺失的hAMSCs-CM促角质形成细胞迁移能力明显下降。3、LOXL2可明显升高角质形成细胞分化指标的表达。4、LOXL2可有效促进创面愈合速率,恢复表皮完整性。5、JNK抑制剂预处理明显抑制了LOXL2促进角质形成细胞迁移的能力和分化指标的升高。6、LOXL2可以激活角质形成细胞JNK和YAP1磷酸化。结论:hAMSCs-CM可促进角质形成细胞迁移,加速背部创伤模型小鼠创面愈合速率。通过质谱分析技术鉴定羊膜间充质干细胞含有丰富的调控因子,是重要的研究和开发资源。hAMSCs外分泌蛋白LOXL2通过激活JNK-YAP1磷酸化促进角质形成细胞迁移和分化,从而加速创伤愈合。