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背景:淋巴瘤是目前发病率增长最快的恶性肿瘤之一,B细胞淋巴瘤呈显著上升趋势。乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染常见于亚洲和非洲,中国是HBV感染高流行区。流行病学研究证实过去十年间持续乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性的HBV感染与B细胞非何杰金淋巴瘤(Non-Hodgin’s Lymphoma,NHL)正相关,HBV感染患者较未感染者发展为B细胞NHL的风险高2~3倍。已证实慢性HBV感染增加NHL风险,但是机制不明。许多基础研究表明HBV不仅有嗜肝细胞性,也有嗜淋巴细胞性。国外学者提出了一种以HBV感染、整合以及慢性抗原刺激(chronic antigenic stimulation,CAS)与淋巴瘤生成的因果关系的多因素模型,其中HBV感染起着必要但并非充分的病原学作用。本研究用重组HBsAg刺激人类外周血淋巴母细胞系IM-9,模仿慢性乙肝病毒的HBsAg的持续刺激作用,探讨慢性HBV感染发展为B细胞NHL的作用机制。方法:1.人外周血淋巴母细胞系IM-9是人类B淋巴细胞经EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)永生化的结果,不具有肿瘤特征,可以作为基因和功能研究。2.细胞增殖实验(Cell proliferation assay,MTS)检测IM-9细胞分别与不同浓度HBsAg(100 ug/mL、200 ug/mL、400 ug/mL)共孵育培养24 h、48 h、72 h后,检测细胞的增殖百分比。3.Annexin V-FITC/7AAD双染法检测细胞凋亡水平,FACS分析IM-9细胞分别与(100 ug/mL,200 ug/mL、400 ug/mL)的重组HBsAg共孵育培养24 h、48 h、72h后,IM-9细胞凋亡率的变化。4.westernblot法分析im-9细胞经不同浓度hbsag(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)处理后,对sirt1-nf-κb信号通路关键分子组蛋白h3乙酰化作用、p21表达及相关凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl、bcl-xl、bax、sirt1、nf-κb的表达影响。5.酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassays,elisa)检测细胞因子il-4、il-10、il-12,趋化因子ip-10、rantes水平。6.沉默信息调节因子1(silentinformationregulator1,sirt1)激活剂srt1720(srt),sirt1抑制剂尼克酰胺(nicotinamide,nam)分别与200ug/mlhbsag共孵育培养im-9细胞48h后,检测细胞活力、细胞凋亡水平变化,westernblot法分析hbsag诱导的组蛋白h3乙酰化以及p21、sirt1和nf-κb的表达水平。结果:1.im-9细胞与不同浓度(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的重组hbsag共孵育培养24h、48h、72h后,细胞增殖百分比随hbsag浓度和时间增加而逐步上升,24h细胞增殖百分比(79.87±2.39、85.92±3.70、92.02±1.52),48h细胞增殖百分比(74.26±1.34、82.15±1.02、93.47±3.25),72h细胞增殖百分比(55.60±2.38、72.89±3.20、94.15±2.32)分别与24h对照组(pbs)(72.34±1.88),48h对照组(pbs)(61.23±2.41),72h对照组(pbs)(32.71±1.57)相比,差异具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)。2.im-9细胞分别与(100ug/ml,200ug/ml、400ug/ml)的重组hbsag共孵育培养24h、48h、72h后,annexin-v/7-aad染色,facs(流式细胞仪)分析细胞凋亡,im-9细胞凋亡率随着hbsag浓度及孵育时间增加而降低,24hannexinv+/7aad+凋亡率(9.34±1.15、7.57±0.46、5.97±1.02),48hannexinv+/7aad+凋亡率(8.06±0.44、5.89±1.02、4.37±0.33),72hannexinv+/7aad+凋亡率(7.27±0.19、3.92±0.86、2.17±1.03),分别与24h对照组(pbs)(13.27±2.60),48h对照组(pbs)(12.43±3.01),72h对照组(pbs)(14.51±1.11)相比,处理组与对照组比较,差异具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)3.im-9细胞分别与100ug/ml,200ug/ml、400ug/ml的重组hbsag共孵育培养48h后进行western-blot分析,与对照组(pbs)相比,随着hbsag浓度升高组蛋白h3乙酰化作用和p21的表达降低。4.im-9细胞分别与100ug/ml,200ug/ml、400ug/ml的重组hbsag共孵育培养48h后western-blot分析,与对照组(pbs)相比,随着hbsag浓度升高上调bcl-2、bcl-xl、sirt1、nf-κb的表达,下调bax的表达,caspase9水平没有改变。5.im-9细胞分别与100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml的重组hbsag共孵育培养48h后humanthirty-plexantibodybeadkit检测细胞因子il-4、il-10、il-12和趋化因子ip-10、ranet水平。hbsag引起il-4和il-10的水平升高,同时导致il-12、ip-10和rantes的水平下降。(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的il-4(25.29±1.15、34.57±0.51、43.88±1.49)分别与对照组(pbs)(16.34±2.19)比较具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)。(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的il-10(749.06±2.31、806.25±0.93、1010.19±1.75)分别与对照组(pbs)(601.24±1.52)比较具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)。(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的il-12(36.14±1.27、32.53±2.79、23.77±3.10)分别与对照组(pbs)(47.82±1.31)比较具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)。(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的ip-10(705.06±2.91、629.18±1.02、478.59±2.14)分别与对照组(pbs)(812.59±3.57)比较具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)。(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的ranet(1788.62±3.14、1495.23±1.13、1345.70±1.09)分别与对照组(pbs)(2312.56±2.97)比较具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)。6.srt促进hbsag诱导的im-9细胞增殖,(200ug/ml+10um)hbsag+srt(94.38±2.16)分别与(200ug/ml)hbsag(83.27±1.21)、对照组(pbs)(62.35±2.31)比较具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)。nam抑制hbsag诱导的im-9细胞增殖,(200ug/ml+10um)hbsag+nam(37.48±2.02)分别与(200ug/ml)hbsag(83.27±1.21)、对照组(pbs)(62.35±2.31)比较具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)。srt促进hbsag诱导的抗凋亡活性,(200ug/ml+10um)hbsag+srt(4.71±2.03)分别与(200ug/ml)hbsag(6.53±1.61)、对照组(pbs)(12.35±3.51)比较具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)。nam抑制hbsag诱导的抗凋亡活性,(200ug/ml+10um)hbsag+nam(24.43±1.48)分别与(200ug/ml)hbsag(6.53±1.61)、对照组(pbs)(12.35±3.51)比较具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)。HBsAg诱导的组蛋白H3乙酰化和P21表达水平被SRT增强,被NAM抑制,SIRT1和NF-κB的表达水平上调被SRT增强,被NAM抑制。结论:1.HBsAg促进人外周血B淋巴样母细胞系IM-9的增殖,且呈现剂量和时间依赖性,即随浓度增加及共培养时间延长而作用更为显著。2.HBsAg抑制IM-9细胞凋亡,且呈现剂量和时间依赖性,即随着浓度增加及共培养时间延长而作用更为显著。3.HBsAg抑制IM-9细胞组蛋白H3乙酰化作用,同时下调P21的表达水平,且呈现剂量依赖性,即随浓度增加该作用更为显著。4.HBsAg以剂量依赖方式通过上调SIRT1和NF-κB的表达水平,进一步下调Bax的表达水平从而抑制内源性凋亡通路。同时,其上调Bcl家族抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表达程度,从而抑制细胞凋亡。这些数据与MTS结果一致。5.HBsAg上调Th2细胞分化的必需因子IL-4以及NHL肿瘤细胞生长的关键因子IL-10的血清水平,下调促进Th1细胞分化的细胞因子IL-12和趋化因子IP-10和RANTES的血清水平。Th2免疫反应增强,Thl免疫效应削弱,而减弱的Th1免疫反应在抗肿瘤免疫中至关重要,从而使肿瘤细胞易于免疫逃逸。6.HBsAg诱导的这些反应被SRT促进、NAM抑制。总之,重组HBsAg以剂量和时间依赖方式抑制人外周血B淋巴样母细胞系IM-9凋亡,涉及多种机制:促进增殖,抑制凋亡,调节细胞因子和趋化因子,调控SIRT1-NF-κB信号转导通路和组蛋白H3乙酰化作用。通过重组HBsAg持续刺激模仿慢性抗原刺激,调节SIRT1-NF-κB通路促进人B淋巴母细胞系IM-9增殖。这可能是HBV相关NHL的发病机制。