第一部分慢性乙型肝炎患者TACE基因启动子区甲基化状态的研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)呈世界性流行,据世界卫生组织报道,全球约有20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿人为慢性HBV感染者,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化及原发性肝癌。HBV感染对人类健康造成了很大的威胁,如何控制疾病进展及清除病毒一直是研究热点。在乙型肝炎病毒感染的进展中,e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)血清学转换是一个至关重要的步骤。在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者中,HBeAg的血清学转换意味着临床好转,肝病进入相对稳定期,肝硬化、肝细胞癌的发生率降低。然而,到目前为止,尚没有可有效预测HBeAg血清学转换的敏感分子生物学指标。DNA甲基化是转录水平的DNA修饰方式之一,主要发生在CpG岛上,它是由DNA甲基化酶介导的化学修饰过程,在此过程中DNA序列5’CpG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上共价结合一个甲基基团,见于基因的5’-CG-3’序列,甲基化形成5-甲基胞嘧啶(5-mC),从而改变染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式,达到调控基因表达的作用,参与转录调控、细胞分化、神经发育等许多重要的生物学过程。目前认为,某些特定位点的DNA甲基化修饰方式可以作为临床疾病评估的分子标志物,如乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌和原发性肝癌等,在疾病诊断和临床预警等方面,具有较高的敏感性和特异性。我们在前期研究中也发现,某些基因的启动子区域甲基化,如GSTP1和GSTM3等基因启动子甲基化状态,可以有效预测慢性乙型肝炎和慢加急性肝衰竭的病情轻重。然而,DNA甲基化分子标志物诊断乙型肝炎病情轻重和疾病预后的体系仍未完善,我们仍需要寻找大量与疾病进展密切相关的甲基化位点,用于指导临床诊断和治疗。肿瘤坏死因子-α转化酶(tumor necrosis factor-a-converting enzyme, TACE)属于解整合素和金属蛋白水解酶(a disintegrin and metallopriteinases, ADAMs)家族,分子量为86KD,共包含824个氨基酸,其晶体结构分析显示TACE由多区域的细胞外部分(包括信号肽、催化前区、259个氨基酸残基的催化区和半胱氨酸富含区组成)、穿膜螺旋段和胞浆内段组成。TACE具有蛋白水解酶活性,可裂解多种跨膜蛋白,释放出有活性的可溶性细胞外结构域,可通过多种细胞因子和炎性介质调节参与肝脏炎症损伤。鉴于此,我们推测,TACE基因启动子甲基化状态可能参与的慢性乙型肝炎的发展过程,并有可能作为一个新的分子标志物,用于疾病诊断。在本研究中,我们重点探讨了TACE启动子区甲基化状态是否参与了慢性乙型肝炎的发病过程,并判断TACE启动子甲基化能否作为分子标志物用于HBeAg状态的潜在价值。目的本研究的目的是通过检测及比较HBeAg阳性及阴性CHB患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中TACE基因启动子区甲基化状态,并探讨慢性乙型肝炎患者中TACE基因启动子区甲基化状态的临床价值。方法随机选取80例HBeAg阳性CHB患者、80例HBeAg阴性CHB患者和40例健康对照者(healthy controls,HCs)为研究对象。记录以上研究对象的年龄、性别等指标,收集肝功、肾功、HBeA定量、HBV DNA定量等临床指标。提取其PBMCs基因组DNA,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-spec ific polymerase chain reaction,MSP-PCR)法检测各组TACE基因启动子区的甲基化状态。数值变量资料用中位数(25百分位数,75百分位数)表示,分类变量表示为用百分比表示。所有统计学处理采用统计软件SPSS 16.0(美国芝加哥)分析。分类变量比较应用卡方检验,数值变量比较应用t检验或曼-惠特尼U检验(Mann-hitney U test),TACE甲基化与临床参数应用斯皮尔曼相关系数进行相关性分析。所有的统计检验均为双侧概率检验,P<0.05定为差异有统计学意义。结果1、CHB组中TACE基因启动子区的甲基化率(130/160,81.25%)明显低于HCs组(38/40,95%),二者间差异存在统计学意义(χ2=4.501,P<0.05)。2、HBeAg阳性CHB组的TACE基因启动子区的甲基化率(58/80,72.5%)明显低于HBeAg阴性CHB组(72/80,90%；χ2=8.041,P<0.01)和HHCs组(χ2=8.438,P<0.01)。而HBeAg阴性CHB组和HCs组的TACE基因启动子区的甲基化率比较无明显统计学差异(χ2=0.873,P>0.05)。3、在HBeAg阳性CHB组,TACE基因启动子区的甲基化与血清HBeAg(r=-0.602, P< 0.01)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT) (r=-0.461, P< 0.01)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST) (r=-0.329, P< 0.01)水平均呈明显的负相关。在HBeAg阴性CHB组,TACE基因启动子区的甲基化与性别(r=-0.009,P=0.934)、年龄(r=0.023, P=0.842)、HBV DNA(r=0.060, P=0.596)、 ALT (r=-0.111,P=0.327)、AST (r=-0.073,P=0.519)、白蛋白(albumin, ALB) (r=0.016,P=0.886)、总胆红素(total bilirubin, TBIL) (r=-0.144,P=0.201)、凝血酶原活动度(prothrombin time activity, PTA) (r=0.156, P=0.167)和肌酐(creatinine, Cr) (r=-0.023, P=0.836)无明显相关。4.在HBeAg阳性CHB组,ALT<2倍正常上限(ULN)患者的TACE甲基化率(18/20,90%)显著高于ALT≥2ULN患者的TACE甲基化率(40/60,66.7%),二者之间存在明显统计学差异(χ2=4.096,P=0.043),在HBeAg阴性CHB组,ALT<2倍正常上限(ULN)患者的TACE甲基化率(35/38,92.1%)与ALT≥2ULN患者的TACE甲基化率(37/42,88.1%)比较无明显统计学差异(χ2=0.356,P=0.55)。结论我们的研究结果表明在HBeAg阳性CHB中存在着TACE基因启动子区的异常低甲基化,且其甲基化率与血清HBeAg的水平呈明显负相关。因此,TACE启动子区的甲基化或许可作为HBeAg血清学转换的生物标志物。第二部分慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者TACE基因启动子区甲基化状态的研究肝衰竭是临床常见的严重疾病症候群,病死率极高。它是由多种因素引起的严重肝脏损害,导致肝脏的合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍甚至失代偿,出现黄疸、凝血功能障碍、腹水以及肝性脑病等各种临床表现。根据病理组织学特征及病情发展速度,肝衰竭被分为四类：急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭。慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)是在慢性肝病基础上,短期内发生的亚急性肝功能失代偿的临床症候群。在我国,引起ACLF的首要病因是HBV感染,在慢性乙型肝炎基础上发生的ACLF称为慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure, ACHBLF),是我国最常见的肝衰竭类型,占所有肝衰竭数量的80%～90%。在临床上ACHBLF缺乏特异、有效的治疗手段,病情凶险,进展迅速,绝大部分患者预后差。目前为止,ACHBLF的发病机制尚不完全明确。先前的研究表明,TNF-α、可溶性TNFRI(sTNFRI)和sTNFRII在ACHBLF的发病机制中发挥了重要的作用。在大多数炎症机制中,TNF-α的功能主要是增强细胞活性,促进细胞因子的产生和组织破坏。TACE是ADAM家族中的一员,能水解TNF-α前体及TNFR成为可溶性TNF-α、sTNFR。到目前为止,关于TACE与ACHBLF发生、发展关系的研究较少。基因启动子区甲基化是目前研究的热点。在恶性疾病的早期诊断、风险评估、早期复发预测、治疗反应监测及预后判断中,异常的DNA甲基化位点已经成为最有前景的分子标志物之一。为了进一步探讨TACE在肝衰竭发生、发展中的作用,我们研究了TACE基因启动子区甲基化与ACHBLF的关系。目的本研究的目的是通过检测ACHBLF患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的TACE基因启动子区甲基化状态,进一步探讨TACE基因启动子区甲基化在ACHBLF患者发病机制中的作用及对预后的预测价值。方法随机选取45例ACHBLF患者、80例CHB患者和54例HCs作为研究对象。记录所有研究对象的年龄、性别等基本临床指标,收集以上研究对象的肝功、凝血、肾功、HBeAg定量、HBV-DNA定量等实验室检查指标。提取其外周血PBMCs基因组DNA、RNA及血浆,采用MSP-PCR法检测各组PBMCs中TACE基因启动子区的甲基化状态。应用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测各组PBMCs中TACE mRNA表达,应用酶联免疫吸附技术(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测各组血浆TACE,TNF-α,sTNFRI及sTNFRII的表达水平。ACHBLF患者至少随访三个月并记录其预后。数值变量资料用中位数(25百分位数,75百分位数)表示,分类变量表示为用百分比表示。所有统计学处理采用统计软件SPSS 16.0(美国芝加哥)分析。分类变量比较应用卡方检验,各组实验室参数的比较用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test), ACHBLF患者中TACE基因甲基化组与非甲基化组之间的比较应用秩和检验。用乘法极限估计Kaplan-Meier法描绘生存曲线,并应用对数秩检验比较其有无差异。应用受试者工作特征曲线下面积(AUC)来评估TACE基因启动子区甲基化和MELD评分用于预测.ACHBLF患者3个月死亡率的诊断价值。所有的统计检验均为双侧概率检验。P<0.05定为差异有统计学意义。结果1、ACHBLF组的血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)和总胆红素(total bilirubin,TBIL)水平明显高于CHB组及HCs组(P<0.05),血浆凝血酶原活动度(prothrombin time activity,PTA)水平明显低于CHB组及HCs组(P<0.05)。2、45例ACHBLF患者中16例检测到TACE基因启动子区甲基化,比率为35.56%,80例CHB患者中64例检测到TACE基因启动子区甲基化,比率为80%,54例HCs组中有50例检测到。TACE基因启动子区甲基化,比率为92.59%。ACHBLF患者组的TACE甲基化率低于CHB组(χ2=24.69,P<0.01)及HCs组(χ2=35.93,P<0.01)。CHB组的甲基化率低于HCs组,二者间差异存在明显统计学意义(χ2=4.03,P=0.045)。3、ACHBLF患者中TACE基因甲基化组的血清TBIL水平、终末期肝病模型(model for end-stage liver disease,MELD)评分及死亡率均显著低于非甲基化组,而PTA水平(24.811±10.697%)明显高于非甲基化组,均有统计学差异。4. ACHBLF组患者TACE mRNA的水平明显高于CHB组(t=2.41,P=0.02)及HCs组(t=2.95,P<0.01)。而CHB和HCs组之间无明显差异(t=-0.87,P=0.39),TACE基因甲基化与其mRNA的表达呈显著负相关(r=-0.68,P<0.01)。本研究中,发生TACE甲基化的研究对象的TACE mRNA水平显著低于未发生甲基化的研究对象(t=8.11,P<0.01)。5. ACHBLF组患者血浆TACE、TNF-α、sTNFRI、sTNFRII水平明显高于CHB组和HCs组(P<0.01)。CHB组和HCs组之间无统计学差异(P>0.05)。同时,血浆TACE的表达与其mRNA的表达呈显著正相关(r=0.35,P<0.0 1)。6. ACHBLF患者的三个月死亡率为55.56%(25/45)。平均生存时间(从住院计)为50.93(SE 5.48,95%CI 40.19-61.68)天。其三个月的死亡率与TBIL、,PTA. MELD和TACE甲基化显著相关。结论研究表明TACE的低甲基化与ACHBLF患者的病情严重程度一致,TACE低甲基化在ACHBLF的发病机理中起着重要的作用,或可作为判断ACHBLF患者病情变化和预后的生物标志物。