[研究背景及目的]根据有关统计数据显示,自始至终急性冠脉综合征（ACS）[1]都属于一种死亡率、发病率居高不下的疾病。其发病原因是因为患者本身稳定性较差的冠状动脉粥样斑块在多种因素的共同作用下发生破裂的现象,从而对内源性凝血途径和血小板发挥了显著的激活作用,通常能够导致血栓阻断或降低冠脉动脉血流,最终出现诸多临床症状。通过研究能够证明,动脉粥样硬化斑块是否稳定[2]及其具体的结构对于患者的预后具有关键性影响,甚至要比狭窄程度这一指标的影响程度更大,根据有关统计数据可知。并且冠状动脉粥样硬化斑块的稳定性与其所包含的巨噬细胞数目之间存在明显的正相关关系[2],如果斑块稳定性较低,那么其中的巨噬细胞浸润就较多,反之则较少。巨噬细胞对于许多细胞因子都具有激活作用,由此能够进一步引发慢性炎症,从而导致斑块稳定性迅速降低。所以,如何避免斑块稳定性降低[3],降低巨噬细胞导致炎症的可能性,提升斑块的稳定性为现阶段国内外有关学者广泛关注的焦点问题之一。通过有关研究能够得出,从正常人的动脉组织来看,蛋白水解酶的不具有活性的,然而从高稳定性较差的粥样斑块中来看,其机制金属蛋白酶[4]一类的蛋白水解酶受到激活作用后,迅速将粥样斑块的斑块纤维帽细胞外基质进行降解,造成纤维帽的厚度降低,加速了斑块的破裂。CD147[5],是一种对于基质金属蛋白酶来说能够发挥促进作用的关键性细胞因子,其能够利用若干种细胞通路不断刺激分泌更多的MMPs[6]。如何降低斑块中含有的巨噬细胞分泌的MMP量[4],是国内外有关研究人员予以高度重视的问题之一。真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）[6]的特点是保守性较强,并且是小分子蛋白,在蛋白的翻译过程中发挥着关键性作用。4E-BP1能够和脚手架蛋白eIF4G通过竞争性的结合方式共同协作完成起始因子eIF4E的转录过程,其磷酸化修饰过程结束后能够自动和eIF4E发生解离,此蛋白可以对cyclinD1的翻译、与PLK1[6]相互作用等发挥不容忽视调节作用,从而进一步对细胞周期的进程产生作用。通过长期、大量的临床研究能够得出,4E-BP1和肿瘤细胞[6]所具有的侵袭力等多种方面存在密切的联系。此外,4E-BP1在机体内多个系统、器官以及细胞中都有广泛的表达,所以,由此作出如下假设:4E-BP1对于巨噬细胞来说具有功能性表达,并且或许能够在MMP的诱导以及表达中发挥作用。本次实验的模型选定为THP-1巨噬细胞,探究真核翻译的起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）对于CD147在诱导THP-1源巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶9（MMP9）时所发挥的具体作用、确定能够有效防控急性冠脉综合征（ACS,acute coronary syndrome）的潜在靶点。对实验所用的巨噬细胞完成分组的过程,分组数目等于5组,（0h,1h,3h,6h,9h）,对照组所对应的是0h。通过Western blot技术对4E-BP1、MMP9所分别对应的转录和翻译水平进行精准的检测。同时,以进一步明确p4E-BP1 对于CD147分泌MMP9的过程中能够发挥何种作用,我们加入了 AKTi抑制4E-BP1磷酸化6h后的后观察4E-BP1,p4E-BP1以及MMP9分别具有怎样的蛋白表达水平。[方法]1.THP-1通过含有血清的培养基在37℃的温度条件下,置于含有5%CO2的培养箱中进行恒温培养,完成传代过程,随后再通过无血清培养基对细胞浓度进行调节为106/ml,按照每孔1ml的量接种于6孔板,通过5ng/ml的佛波酯进行刺激,时间等于48小时,随后能够进一步通过分化过程得到巨噬细胞模型。随后需要将培养基换为含有血清的培养基,为巨噬细胞的活力提供保障。2.Western Blot通过利用4℃的RIPA裂解液实现细胞的裂解,在冰上完成裂解过程,时间等于10min,基于4℃的温度条件,以10cm的半径以及12000r/min的转速进行离心操作,时间10min,收集处理后的上清液。蛋白浓度需要进一步测定。后添加50μg总蛋白样品,完成混匀的操作后在100℃的温度下煮沸,经5min后,展开垂直电泳,后经湿转法完成转膜过程,随即再通过5.0%脱脂奶粉,室温条件下培养1h,用TBST重复进行洗膜处理,一次时间为5min。一抗在4℃的温度条件下进行过夜孵育,再利用TBST洗膜,重复三遍,一遍时间为1Omin,二抗在室温下进行2h的孵育。通过（Odyssey 2.0）软件完成扫描以及分析的过程。结果也要重复进行三遍。3.CCK8法对细胞活性进行测量,将100μl细胞悬液接种于96孔板,在培养箱中进行24小时的连续培养,随后在每孔内添加10μl AKTi的CCK-8溶液,当时间足够的情况下通过酶标仪对450nm处所对应的吸光度进行精准的检测。[结果]1.巨噬细胞模型建立成功:THP-1细胞通过在5ng/ml的PMA产生诱导作用,在显微镜下进行观察能够发现THP-1细胞能够缓慢地聚集成团状,并逐渐伸出伪足以及贴壁,由此通过分化过程转化为巨噬细胞。在进行48h的刺激分化后通过细胞计数的比较能够得出,最终的诱导率能够超过95%。2.CD147对巨噬细胞产生刺激作用后通过时间依赖性这一途径来提升p4E-BP1、MMP9在蛋白水平上的表达程度。对细胞进行分组,分别是CD147刺激0h组、1h组、3h组、6h组、刺激9h组。通过使用1ng/ml CD147对巨噬细胞进行刺激完毕后,蛋白表达量都能够得到提升,并且p4E-BP1所对应的相对蛋白表达量在6小时的时间节点上达到了最高点,MMP9所对应的的蛋白表达量在6小时的时间节点上也达到了最高点。3.CD147完成对巨噬细胞的刺激过程后,能够通过剂量依赖这一途径有效促进p4E-BP1、MMP9基于蛋白水平的表达。通过利用浓度分别等于0,0.1,0.5,1,5,10ng/ml的CD147对巨噬细胞进行刺激,时间为6小时,最终结果表明浓度在0.1-1ng/ml的范围内具有剂量依赖性,浓度等于1ng/ml的情况下剂量依赖性最强,然而在浓度等于1-1Ong/ml的范围内不存在统计学差异。4.通过利用AKTi[7]对4E-BP1的磷酸化过程进行抑制,CD147刺激巨噬细胞,时间为6h,随后将MMP9蛋白表达与对照组进行全面对比分析可知其出现了显著的降低趋势,具体降低了 p4E-BP1（0.0967±0.0153 vs.1,P<0.05）、MMP9（0.1533±0.0252 vs.1,P<0.05）的蛋白表达水平.[结论]p4E-BP1通过CD147对单核-巨噬细胞进行刺激后得到的MMP9的关键性通路,对于ACS的发生以及发展可能具有重要意义。