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目的:构建抗耐药结核重组质粒DNA疫苗p IEMKMAGP,并初步评价其免疫效果,为临床耐药结核病的治疗提供新的选择。方法:(1)利用DNA重组技术,将结核分枝杆菌表面抗原MPT64、Ag85B基因编码区和野生型kat G基因编码区,以及穿孔素PRF1、颗粒溶素GNLY基因编码区插入到真核表达载体p IRES2-EGFP中,构建抗结核多基因真核串联表达载体p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1);(2)利用电转化的方法,将质粒p IEMKMAGP转化耻垢分枝杆菌制备重组耻垢分枝杆菌菌苗;(3)利用脂质体转染技术,将质粒p IEMKMAGP转染293T细胞,应用荧光定量PCR技术检测目的基因表达水平,应用Western blot技术检测目的蛋白表达情况;(4)质粒p IEMKMAGP免疫接种C57BL/6小鼠和SD大鼠,ELISA试剂盒检测IL-12和IFN-γ细胞因子表达水平。结果:(1)成功构建了抗耐药结核多效基因工程DNA疫苗p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1);(2)成功制备重组耻垢分枝杆菌菌苗;(3)目的基因MPT64/Ag85B、kat G、GNLY/PRF1在293T细胞中成功表达,融合蛋白MPT64/Ag85B、融合蛋白GNLY/PRF1成功表达,且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表达;(4)目的基因MPT64/Ag85B、kat G、GNLY/PRF1在C57BL/6小鼠组织器官m RNA水平上有一定表达,但蛋白水平上未检测到目的蛋白的表达;(5)质粒p IEMKMAGP免疫接种SD大鼠中外周血血清中的IL-12和IFN-γ细胞因子表达水平明显升高。结论:(1)抗耐药结核真核表达质粒p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1)作为DNA疫苗能够在细胞水平上有效表达,有望为进一步开发新型的抗结核疫苗提供了实验依据。(2)本研究构建的抗耐药结核DNA疫苗p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1)可以引起IL-12和IFN-γ细胞因子水平的升高。