论文部分内容阅读
目的:通过体外试验,初步探讨六价铬（hexavalent chromium,Cr（Ⅵ））诱导Hep3B细胞凋亡与钙稳态失衡之间的关系及相互作用机制。方法:以Hep3B肝癌细胞为受试细胞,通过MTT试验分别检测Cr（Ⅵ）、线粒体保护剂（DZ）及钙离子螯合剂（BAPTA/AM）单独及其与共处理对Hep3B细胞存活率的影响,通过单细胞凝胶电泳实验观察细胞DNA损伤情况,筛选出Cr（Ⅵ）染毒浓度及有效的DZ、BAPTA/AM干预浓度。其后续试验DZ定为50μmol/L,BAPTA/AM为20μmol/L,预处理1h,Cr（Ⅵ）作用浓度为20μmol/L,染毒时间为6h。将Hep3B细胞随机分成对照组（第1组）、Cr（Ⅵ）染毒组（第2组）、DZ+Cr（Ⅵ）干预染毒组（第3组）、BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）干预染毒组（第4组）、BAPTA/AM+DZ+Cr（Ⅵ）联合干预染毒组（第5组）。姬姆萨染色、电镜观察及彗星实验法观察细胞凋亡形态及细胞DNA损伤情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光分光光度法检测线粒体通透性转运孔（PTP）及跨膜电位（△ψm）、荧光比色法检测细胞内钙离子浓度,化学比色法检测线粒体Ca2+-ATP酶。结果:1.Cr（Ⅵ）染毒及干预后染毒处理对Hep3B细胞存活率的影响:不同浓度Cr（Ⅵ）单独处理Hep3B细胞24h,Cr（Ⅵ）染毒各组与对照组相比细胞存活率存在显著性差异（P＜0.05）,随Cr（Ⅵ）浓度的增加,Hep3B细胞存活率有下降的趋势,且存在着浓度-反应关系（P＜0.01）,其相关系数r=-0.948。在50μmol/L浓度的DZ和20μmol/L浓度的BAPTA/AM预处理细胞1h后,20μmol/LCr（Ⅵ）染毒Hep3B细胞的存活率与20μmol/L Cr（Ⅵ）单独处理细胞存活率相比有明显增高。2.染毒与干预处理对Hep3B细胞形态学的影响:光镜下姬姆萨染色观察发现,20μmol/L Cr（Ⅵ）处理6h,引起部分Hep3B细胞皱缩或肿大,染色质浓染,细胞间隙扩大,胞质间空泡增多,细胞膜和核膜不完整或消失,染色质嗜碱性降低;DZ和BAPTA/AM预处理细胞1h后Cr（Ⅵ）染毒6h,可见大部分细胞生长状况良好,部分细胞胞质出现空泡,少部分细胞核膜不完整。电镜下观察,可发现Cr（Ⅵ）染毒组细胞出现表面微绒毛减少,线粒体肿胀、嵴消失、空泡状变,细胞核内出现透亮区、呈空泡状变等细胞凋亡或坏死的表现;DZ预处理对线粒体有一定的保护作用。3.染毒与干预处理对Hep3B细胞DNA损伤的影响:Cr（Ⅵ）染毒组、DZ+Cr（Ⅵ）干预染毒组、BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）干预染毒组与DZ+BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）联合干预染毒组细胞DNA损伤程度与对照组相比显著增加（P＜0.05）,而加入线粒体保护剂DZ和细胞内钙离子螯合剂BAPTA/AM预处理后,各干预染毒组与Cr（Ⅵ）染毒组相比,DNA损伤程度明显减轻（P＜0.05）。4.染毒与干预处理对Hep3B细胞凋亡的影响:流式细胞仪检测显示20μmol/L Cr（Ⅵ）染毒组坏死细胞和凋亡细胞比对照组明显增多;DZ、BAPTA/AM预处理细胞1h后Cr（Ⅵ）染毒6h,各干预处理组正常细胞比Cr（Ⅵ）染毒组明显增多,坏死细胞和凋亡细胞,比Cr（Ⅵ）染毒组明显减少。5.染毒与干预处理对Hep3B细胞线粒体膜的影响:Cr（Ⅵ）染毒组及各干预染毒组细胞与对照组相比PTP开放度明显增加（P＜0.05）,线粒体膜电位明显降低（p＜0.05）;各干预染毒组与Cr（Ⅵ）染毒组相比PTP开放度明显降低（P＜0.05）,线粒体膜电位明显升高（P＜0.05）。6.染毒与干预处理对Hep3B细胞内Ca2+浓度的影响:Cr（Ⅵ）染毒组及各干预染毒组与对照组相比,细胞内Ca2+浓度明显增加（P＜0.05）;各干预染毒组与Cr（Ⅵ）染毒组相比,细胞内Ca2+浓度明显降低（P＜0.05）。7.染毒与干预处理对Hep3B细胞质膜和线粒体膜Ca2+-ATP酶的影响:Cr（Ⅵ）染毒组、BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）干预染毒组细胞膜Ca2+-ATP酶活力比对照组明显降低（P＜0.05）;各干预染毒组细胞膜Ca2+-ATP酶活力与Cr（Ⅵ）染毒组比较明显增加（P＜0.05）。Cr（Ⅵ）染毒组及各干预染毒组线粒体膜Ca2+-ATP酶活力与对照组相比均明显降低（P＜0.05）;DZ+Cr（Ⅵ）干预染毒组、DZ+BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）联合干预染毒组线粒体膜Ca2+-ATP酶活力与Cr（Ⅵ）染毒组比较明显增加（P＜0.05）。结论:20μmol/L Cr（Ⅵ）能明显诱导Hep3B细胞凋亡,引起线粒体膜及细胞DNA损伤、细胞内Ca2+浓度增加、质膜和线粒体膜Ca2+-ATP酶活力降低,加入线粒体保护剂DZ或（和）钙离子螯合剂BAPTA/AM后可起到相应的拮抗作用。结果提示,Cr（Ⅵ）可能绕过p53环节直接通过损伤线粒体诱导Hep3B细胞凋亡,钙稳态失衡是Cr（Ⅵ）引起Hep3B细胞线粒体损伤性凋亡的重要机制。