研究背景和意义：胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，其发病率高，预后差。胶质瘤中约80％的病变为恶性，主要包括胶质母细胞瘤和间变性胶质瘤。虽然近年来出现了以手术为主，联合放疗、化疗的综合治疗方案，和一些针对肿瘤血管新生的靶向治疗药物，但恶性胶质瘤患者的5年生存率仍然没有得到显著改善。部分胶质瘤患者在接受治疗后还出现肿瘤复发进展、恶性程度增高的现象。这主要是因为恶性胶质瘤特别是胶质母细胞瘤呈浸润性生长，肿瘤细胞沿神经纤维和毛细血管侵犯生长，与正常脑组织、神经纤维和血管分界不清，手术难以彻底切除。此外，手术和放疗区域大量增生的神经胶质，也给残留和复发肿瘤组织的检测带来了很大困难。因此对胶质瘤进行非侵入性的早期诊断、准确定位和边界显示，并区分正常脑组织、肿瘤和增生的神经胶质，对治疗和预后具有十分重要的意义。目前胶质瘤的诊断主要依靠影像学手段，特别是磁共振和核素扫描。但磁共振和核素检查对体积较小、血脑屏障破坏较轻的肿瘤检测的敏感度和特异度较低。如何在提供详细解剖学细节的基础上实现对胶质瘤高敏感度、高特异度的非侵入性的显像，成为全世界范围内研究人员和医务工作者面临的巨大挑战。　　 随着科技的进步和生命科学的发展，在最近几十年出现了以能够在活体状态下利用影像学方法在细胞和分子水平上研究生物体内生化进程为目标的新兴学科——分子影像学(MI)。MI的最显著特点是借助各种分子探针，利用磁共振(MRI)、光学、核素和超声等影像学技术，实现对单个细胞、乃至单个分子的非侵入性显像。作为生命科学研究的有力工具，分子影像自诞生之初就广泛应用于重大疾病研究、药物研发、干细胞治疗（示踪）等生物医学研究领域，并发挥着越来越重要的作用。而作为MI最为关键的环节，分子成像探针的研发也一直处于分子影像研究的最前沿，并取得了令人瞩目的成就。　　 然而，随着生命科学研究的不断深入，单纯依靠一种成像方法已经不能满足人们对MI成像精准度的要求。因此，将多种成像模式的分子探针进行融合，开发能同时满足多种成像模式需求的分子探针成为了广大分子影像研究工作者关注的焦点。在MI传统的成像方法中，MRI和光学成像以其无创、实时、无X线电离辐射和可重复性高等优势一直是国内外学者研究的热点，也是最具发展前景的成像手段。MRI和光学探针的融合，不仅可以提高探针的敏感度，而且能够提供靶器官详细的软组织解剖细节，满足早期、动态、实时、无创和精准成像的要求。　　 在本项目中针对当前胶质瘤研究的热点问题，利用具备良好生物相容性的介孔二氧化硅(MSNs)材料、有机近红外荧光染料(IR-808)和磁共振含钆对比剂(Gd-DTPA)构建具有近红外(NIR)光学和磁共振双模态成像功能的分子探针，并建立人胶质母细胞瘤皮下肿瘤模型，探讨所构建分子探针的稳定性、靶向成像的效果和生物相容性。以期通过构建的双模态成像分子探针，为胶质瘤的早期诊断提供新的技术支持。　　 研究目的：　　 一、探讨近红外花菁类染料IR-808对胶质瘤、乳腺癌等恶性肿瘤靶向成像的可行性，并对IR-808的生物相容性进行研究，为后期双模态成像探针的构建寻找合适的NIR光学成像探针;　　 二、构建具有良好单分散性、高比表面、规则孔道结构和生物相容性的介孔二氧化硅纳米材料，为进一步构建具有MRI和NIR双模态成像的分子探针提供生物纳米材料载体;　　 三、构建具有良好水溶性、生物相容性的MRI和NIR多功能双模态成像探针，并检验其在体外和活体组织内成像的可行性;　　 四、探讨所构建的多功能双模态探针对人胶质母细胞瘤(U87-MG)裸鼠模型成像的可行性及其应用价值。　　 研究方法、内容和结果　　 一、近红外花菁类染料IR-808对胶质瘤的靶向性光学成像研究　　 1、肿瘤细胞培养和标记C6细胞的培养采用含胎牛血清(15％)、马血清(2.5％)和1％双抗（100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素）的F12 Kaighn's培养基，人胶质母细胞瘤细胞U87-MG和人乳腺癌细胞MDA-MB-231的培养采用含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养基;所有细胞均在细胞培养箱内以37摄氏度(℃)、5％ CO2及饱和湿度条件下的连续培养传代，所有细胞均贴壁生长。24孔板每孔中加入1μlIR-808溶液(10mM)在37℃细胞培养箱内孵育10-15 min。多聚甲醛固定后，进行DAPI染色。荧光倒置相差显微镜观察显示:IR-808在体外显示出对大鼠胶质瘤C6细胞、人胶质母细胞U87-MG均具有良好的靶向性;荧光显微镜照片显示，IR-808均匀分布于C6、U87-MG和MDA-MB-231细胞体内，胞核未见近红外荧光染色;而人胚肾细胞HEK293T胞体呈微弱近红外荧光。　　 2、IR-808的细胞毒性试验人胚肾细胞HEK293T采用含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养基;在细胞培养箱内以37℃、5％ CO2及饱和湿度条件下的连续培养传代，HEK293T细胞贴壁生长。MTT法计算IR-808的细胞毒性表明正常剂量浓度(20μmol/L)的IR808溶液在共孵育48h时对人胚肾细胞HEK293T的生长无明显影响，2倍于正常浓度的IR808溶液在48h后明显降低了HEK293T细胞的增殖。　　 3、近红外花菁类染料IR-808靶向MDA-MB-231乳腺癌和C6胶质瘤的活体实验当裸鼠皮下肿瘤直径达约0.5cm时，经尾静脉注射200μl IR-808溶液(0.05mM)。24h后进行光学成像检测，激发波长为778nm，发射光波长为808nm。　　 乳腺癌肿瘤部位有较明显的近红外荧光信号，且具有良好的背景噪声比。将肿瘤组织完整切除后，体外近红外荧光成像也显示出较高的近红外信号。　　 BALB/C裸小鼠胶质瘤原位模型活体近红外荧光成像显示肿瘤接种部位有较强的荧光信号，荧光强度可以穿透裸小鼠的颅骨;而SD大鼠活体不能观察到光学信号。处死动物进行脑组织体外成像时，见BALB/C裸小鼠和SD大鼠脑组织肿瘤组织均有较强的近红外荧光。　　 二、基于带氨基介孔二氧化硅纳米颗粒磁共振和光学双模态探针的制备　　 1、介孔二氧化硅纳米颗粒的制备和表征根据参考文献的方法，0.4g十六烷基三甲基溴化铵溶于567.5ml去离子水中，加入3.52ml乙酸乙酯和12.12ml氨水，加入0.9ml正硅酸四乙脂和1.1ml（3-氨丙基）三乙氧基硅烷。将混合液在室温下以300转/分(rpm)充分搅拌反应24小时(h)。去离子水清洗3次，无水乙醇清洗1次。在样品中加入120 ml无水乙醇和240μl浓盐酸，在60摄氏度水浴锅中搅拌反应3h。去离子水清洗3次，定容至5ml。　　 场发射扫描电子显微镜的照片使用Hitachi S4800型扫描电子显微镜拍摄，加速电压为1kV。透射电子显微镜(TEM)的照片使用日本JEOL公司JEM-2100型透射电子显微镜拍摄，加速电压为200kV。通过测量约100个纳米颗粒的直径，计算得到MSNs-NH2的平均粒径为120nm(60～160 nm)。氮气吸附-脱附等温线使用北京金埃谱科技有限公司V-Sorb2800P比表面积及孔径分析仪在-196℃测试，测试前将样品在13，200rpm离心10min后，在70℃烘箱内彻底干燥，研磨成均匀粉末状，并在180℃条件下脱气6小时。采用Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法在吸附曲线p/p0=0.05～0.15处计算样品的比表面积为～473m2/g;采用Barrett-Joyner-Halenda(BJH)分析法基于吸附数据计算MSNs-NH2的孔径为3nm。介孔二氧化硅材料的傅立叶变换红外光谱使用美国Thermo Nicolet公司NEXUS870型傅立叶红外光谱仪测定。元素分析使用德国Elementar公司Vario MICRO型元素分析仪表明MSNs-NH2的质量百分含量为2.67％。使用英国Malvern公司Nano-Z型Zeta电位仪分析定容后MSNs-NH2的Zeta电位为+32mV。　　 2、MSNs-Gd/NIR双模态成像分子探针的构建和表征0.7mg近红外花菁类染料IR-808和4ml0.1摩尔每升的Gd-DTPA溶液加入20mlMES缓冲液(0.1M)中;加入N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐0.4mg，室温下避光搅拌2h;然后加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐0.6mg，室温下避光搅拌活化反应3～4 h。加入1ml介孔二氧化硅溶液，避光反应过夜。　　 使用美国Thermo Nicolet公司NEXUS870傅立叶红外光谱仪分析介孔二氧化硅修饰IR-808和Gd-DTPA前后的近红外光谱。紫外-可见吸收光谱检测表明IR-808与MSNs-NH2的连接系数为0.3％;美国PE公司OPTIMA5300DV型电感耦合等离子体发射光谱仪ICP显示MSNs-Gd/NIR中钆的浓度为0.009M;不同浓度梯度Gd MR成像结果显示MSNs-Gd/NIR比市售的Gd-DTPA具有更高的弛豫率，能更加显著的缩短T1弛豫时间。使用英国Malvern公司Nano-Z型Zeta电位仪分析定容后MSNs-Gd/NIR的Zeta电位为+7.35mV.　　 3、MSNs-Gd/NIR的细胞毒性试验人胚肾细胞HEK293T采用含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养基;在细胞培养箱内以37℃、5％ CO2及饱和湿度条件下的连续培养传代。MTT检测MSNs-Gd/NIR对HEK293T细胞的生长无明显抑制作用。　　 三、MSNs-Gd/NIR靶向人胶质母细胞瘤U87-MG的体外细胞及荷瘤裸鼠活体试验研究　　 1、肿瘤细胞对MSNs-Gd/NIR的摄取吸取100μl前面所制备的MSNs-Gd/NIR溶液(50mg/ml)，13，000rpm离心10min后，加入1ml DMEM培养基，超声充分溶解后，分别取20μl加入24孔板内，每孔MSNs-Gd/NIR的终浓度为100μg/ml。在37℃细胞培养箱内孵育2～3 h。使用PBS清洗细胞3次，每孔加入300μl多聚甲醛固定30min; PBS再次清洗细胞3次;每孔加入300μl DAPI溶液孵育20min。弃去染色液，PBS清洗1次，在载玻片上滴加1滴甘油，将盖玻片倒扣于载玻片上，指甲油封片。使用Olympus荧光倒置相差显微镜观察细胞的染色情况。结果表明C6胶质瘤细胞和U87-MG-GFP细胞内均有较强的近红外荧光。　　 2、大鼠神经胶质瘤细胞C6的MRI和NIR体外成像在C6细胞培养瓶内加入一定量的MSNs-Gd/NIR（终浓度为200μg/ml），对照组C6细胞培养瓶内加入同等量的DMEM培养基;两组细胞均在37℃细胞培养箱内孵育4h后，进行MRI和NIR光学成像。结果显示MSNs-Gd/NIR组C6细胞的TI值明显低于对照组。　　 3、MSNs-Gd/NIR靶向胶质瘤的活体实验在人胶质母细胞瘤U87-MG裸鼠皮下肿瘤模型建立成功后，向肿瘤内注射50μl MSNs-Gd/NIR溶液(5mg/ml)，分别在注射后0、1、4、8、12、24和48h后分别行MR和近红外光学检查，在48h后脱颈处死动物，并取肿瘤组织和各重要脏器进行近红外荧光成像。　　 MRI扫描用德国SIMENS公司MAGNETOM Trio3.0 T磁共振扫描仪和定制小动物线圈（4通道）;扫描具体参数如下:横断位T1WI，TR=670ms，TE=11ms,Average=4,Slice Thickness:2.0mm,FOV=60mm,Flip Angle=150;T2WI, TR=3100ms, TE=98ms,Average=4,Slice Thickness:2.0mm,FOV=60mm,Flip Angle=120;T1Map: TR=15.0ms, TE=1.73ms, Average=2, Slice Thickness:2.0mm，FOV=113mm，Flip Angle=5，26。小动物活体成像仪光学检查使用美国Xenogen公司的IVIS Lumina XR系统，激发波长为778nm，发射光波长为808nm。　　 在肿瘤内注射50μl MSNs-Gd/NIR溶液(5mg/ml)后，近红外荧光和MR动态观察肿瘤信号的改变。在瘤内注射48小时，肿瘤内仍然能够观察到明显的近红外荧光信号，在MR T1 WI上肿瘤内部可以观察到稍高于正常肿瘤组织的信号，范围较前扩大。在完成MR和NIR荧光扫描后，处死动物。取心、脑、肺、肝脏、脾脏、肾脏、小肠和皮肤进行近红外荧光检测，结果显示:肿瘤组织内有较为均匀的近红外荧光显示。　　 研究结论：　　 1、近红外花菁类染料IR-808具有靶向胶质瘤的作用，且具有良好的生物相容性，有望作为胶质瘤近红外光学成像的分子探针。　　 2、所制备的带氨基的介孔二氧化硅材料具有较大的比表面积、规则的孔道、良好的单分散性和水溶性，有望作为构建多模态成像和诊断治疗学探针的载体。　　 3、所构建的近红外光学和磁共振双模态分子探针MSNs-Gd/NIR具有稳定的光学量子输出和显著的T1弛豫率，生物相容性良好，且非特异性的靶向胶质瘤。有望作为胶质瘤研究的多模态成像工具，用于肿瘤的早期诊断和药物疗效监测。　　 研究的主要创新点1、有学者发现新型近红外花菁类染料IR-808能够对肺癌、宫颈癌等多种上皮组织来源的恶性肿瘤进行靶向NIR成像，但目前尚未见有利用IR-808对胶质瘤进行成像研究的报道。本项目率先将IR-808应用于BABL/c裸小鼠原位胶质瘤的光学成像研究，发现IR-808的NIR信号可以穿透BABL/c裸小鼠的颅骨，实现原位胶质瘤的非侵入性NIR成像，显示了良好的研究和应用前景。　　 2、以往虽然有文献报道利用有机染料和含钆对比剂制备MRI/NIR双模态纳米探针，但其探针的载体制备方法较为繁琐。本项目制备了表面带有大量氨基的介孔二氧化硅纳米颗粒，无需表面修饰即可通过羧合反应连接新型近红外探针IR-808和市售的Gd-DTPA，构建了具有较高T1弛豫率、稳定近红外量子输出、较长成像时间效果的双模态探针;由于作为探针载体的介孔二氧化硅具有规则的孔道结构，因此有望同时装载药物，进一步构建兼具诊断和治疗作用的多功能诊断治疗学探针，实现诊疗一体化。