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棉花是世界性重要的农业经济作物,棉花产业对社会经济发展具有战略意义。农产品供给侧结构性改革,使棉花生产由追求高产转向重点提升品质。棉纤维品质也是衡量棉花品质的关键指标之一,提高棉纤维品质也成为当前棉花遗传育种的重要目标之一。然而,棉纤维发育是一个复杂的过程,受大量基因调控并最终影响纤维品质及产量,因此,对棉纤维发育相关基因的克隆和功能研究可为改良棉纤维品质提供理论依据。同时,海岛棉具有优良的纤维品质,其内在的优异基因也成为棉花品质改良的研究对象。此外,TCP转录因子广泛参与植物的生长发育过程,在棉花中,已有多个TCP基因被克隆并证实与棉纤维及表皮毛发育有关。因此,本研究从海岛棉中克隆获得一个TCP家族转录因子GbTCP44的cDNA全长,解析其基因结构,通过实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式,运用酵母系统分析其转录激活活性,利用原核表达分析摸索其蛋白诱导的最佳条件,并利用VIGS技术分析该基因的生物学功能,以期为棉花纤维品质的改良提供科学的理论依据。主要研究结果如下:
1.以海岛棉‘新海21号’为实验材料,运用RT-PCR技术克隆得到海岛棉GbTCP44基因的cDNA序列,借助生物信息学分析该基因,其编码区序列全长为1035bp,共编码344个氨基酸,预测分子式为C1618H2538N484O525S13,分子量约为37.59KD,等电点为8.83;其序列(N端)有一个高度保守的TCP功能结构域,属于TCP转录因子家族ClassⅠ成员;其二级结构由12个α-螺旋、4个β折叠和无规则卷曲组成;其氨基酸序列不存在信号肽;该蛋白不存在跨膜区,是一亲水性较强的蛋白并可能存在蛋白质磷酸化现象。
2.亚细胞定位显示GbTCP44基因定位在细胞核中,属于核表达蛋白;转录激活活性分析证明GbTCP44蛋白具有转录自激活功能;原核表达分析表明GbTCP44蛋白在IPTG浓度0.8mmoL/L、37℃、6h诱导条件下能高效表达。
3.表达模式分析发现,GbTCP44基因在生殖器官中的表达量显著高于营养器官的表达量;该基因在棉纤维发育20d时的表达量最高;当棉纤维发育至25d和30d时,该基因在长纤维品种中的表达量比在短纤维品种中的表达量低,存在显著差异(P<0.05),表明GbTCP44基因可能参与棉花纤维伸长期的纤维细胞伸长的发育。
4.VIGS技术沉默棉花GbTCP44基因的研究显示,使用烟草脆裂病毒质粒成功地构建了pTRV2-GbTCP44沉默载体,并获得了沉默效率较高的(>50%)沉默GbTCP44基因棉花植株。相比对照,(1)该沉默植株生长发育初期至花蕾期,可观察到叶片不对称生长、褶皱甚至畸形的现象,推测GbTCP44基因可能与叶形的发育调控有关。(2)在陆地棉品种‘本-6-2有毛’中沉默该基因,发现沉默棉花植株相比对照植株的茎秆表皮毛数量减少59%,推测GbTCP44基因可能参与调控植物表皮毛的发育。(3)通过qRT-PCR分析棉纤维发育相关基因在沉默GbTCP44基因植株中的表达量,结果显示:相比对照,GhSK13、GhNAC1、GhCAM7和GhCPC基因表达量显著升高;GhPRP5、GhSUSAI和GhFLA基因的表达量显著降低,揭示GbTCP44基因可能与以上基因存在直接或间接作用关系参与棉花纤维发育的调控。
1.以海岛棉‘新海21号’为实验材料,运用RT-PCR技术克隆得到海岛棉GbTCP44基因的cDNA序列,借助生物信息学分析该基因,其编码区序列全长为1035bp,共编码344个氨基酸,预测分子式为C1618H2538N484O525S13,分子量约为37.59KD,等电点为8.83;其序列(N端)有一个高度保守的TCP功能结构域,属于TCP转录因子家族ClassⅠ成员;其二级结构由12个α-螺旋、4个β折叠和无规则卷曲组成;其氨基酸序列不存在信号肽;该蛋白不存在跨膜区,是一亲水性较强的蛋白并可能存在蛋白质磷酸化现象。
2.亚细胞定位显示GbTCP44基因定位在细胞核中,属于核表达蛋白;转录激活活性分析证明GbTCP44蛋白具有转录自激活功能;原核表达分析表明GbTCP44蛋白在IPTG浓度0.8mmoL/L、37℃、6h诱导条件下能高效表达。
3.表达模式分析发现,GbTCP44基因在生殖器官中的表达量显著高于营养器官的表达量;该基因在棉纤维发育20d时的表达量最高;当棉纤维发育至25d和30d时,该基因在长纤维品种中的表达量比在短纤维品种中的表达量低,存在显著差异(P<0.05),表明GbTCP44基因可能参与棉花纤维伸长期的纤维细胞伸长的发育。
4.VIGS技术沉默棉花GbTCP44基因的研究显示,使用烟草脆裂病毒质粒成功地构建了pTRV2-GbTCP44沉默载体,并获得了沉默效率较高的(>50%)沉默GbTCP44基因棉花植株。相比对照,(1)该沉默植株生长发育初期至花蕾期,可观察到叶片不对称生长、褶皱甚至畸形的现象,推测GbTCP44基因可能与叶形的发育调控有关。(2)在陆地棉品种‘本-6-2有毛’中沉默该基因,发现沉默棉花植株相比对照植株的茎秆表皮毛数量减少59%,推测GbTCP44基因可能参与调控植物表皮毛的发育。(3)通过qRT-PCR分析棉纤维发育相关基因在沉默GbTCP44基因植株中的表达量,结果显示:相比对照,GhSK13、GhNAC1、GhCAM7和GhCPC基因表达量显著升高;GhPRP5、GhSUSAI和GhFLA基因的表达量显著降低,揭示GbTCP44基因可能与以上基因存在直接或间接作用关系参与棉花纤维发育的调控。