论文部分内容阅读
化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一种条件性致病菌,可引起多种化脓性疾病,如奶牛子宫内膜炎、乳腺炎、肝脓肿和关节炎等,给养殖业造成严重危害。β-内酰胺类抗生素是临床治疗化脓隐秘杆菌感染的首选药,但由于过度使用,甚至不合理使用,导致耐药菌株逐渐增多。细菌对抗生素产生耐药后不仅使药物的疗效下降,而且会对细菌的毒力产生影响。化脓隐秘杆菌的致病力与多个毒力因素密切相关。如溶血素(PLO)、胶原结合蛋白(CbpA)、菌毛(FimA、FimC和FimG)以及神经氨酸酶H(NanH)和P(NanP)。本文通过检测β-内酰胺类抗生素耐药化脓隐秘杆菌菌株NanP表达量的差异,将为深入研究化脓隐秘杆菌耐药对其致病力的影响,及对临床有效治疗化脓隐秘杆菌感染奠定理论基础。本研究通过生物信息学技术的方法对化脓隐秘杆菌NanP的结构域、信号肽及其跨膜区等进行分析预测。结果显示:化脓隐秘杆菌中nanP基因共编码1737个氨基酸,相对分子质量为186.8 kDa,理论等电点为5.56,总平均亲水性指数(GRAVY)-0.351;该基因不含信号肽,含有两个跨膜区,42个磷酸化位点,共含有7个保守结构域,分析序列特异性,发现其序列特异性良好。通过预测NanP的亲疏水性、可塑性、可及性及抗原表位,综合分析,选择50-270氨基酸进行原核表达,为后续试验提供基础。成功构建化脓隐秘杆菌nanP基因的原核表达重组质粒pEASY-Blunt E1-nanP,在大肠杆菌中成功地获得可溶性表达的蛋白;利用Ni-NTA纯化的方法将表达的目的蛋白纯化,纯化后His-NanP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗化脓隐秘杆菌NanP多克隆抗体。制备的多克隆抗体与化脓隐秘杆菌NanP具有良好的反应性,抗体效价达到1:64000。利用Western-blot技术检测不同耐药表型的化脓隐秘杆菌菌株NanP的表达量,并与标准株NanP表达量进行比较。结果表明:随着化脓隐秘杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药谱的增加NanP表达量呈下降趋势。本研究将为深入探讨化脓隐秘杆菌产生耐药性后对其致病力的影响奠定了理论基础。