前言越来越多的研究结果表明，反应性氧自由基在器官移植中发挥重要的作用。反应性氧自由基主要包括过氧化氢（H₂O₂），超氧离子（O-2）和氢氧离子（HO-）。在肝脏的缺血再灌注损伤过程中，首先是早期的反应，也即急性期，发生于灌注后1-6小时，Kupffer细胞首先被激活，释放出大量的炎症因子和细胞因子，并产生了大量的反应性氧自由基。因此，Kupffer细胞是血管中氧自由基的主要来源。同时，kupffer细胞也产生一些细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-1（IL-1）等，其中白介素-1能活化肝脏中CD4+T淋巴细胞而引起免疫损伤，这更加剧了Kupffer细胞的活化和中性粒细胞的聚集。同样地，肝移植术后移植物发生排斥反应时，免疫细胞在汇管区聚集，也能释放和产生反应性氧自由基。而在上述病理改变中，内皮细胞是免疫攻击和损伤的主要靶点，内皮细胞的损伤和失功，是移植物发生功能改变首先要出现的病理现象。因此，本研究主要就内皮细胞为研究对象，来观察反应性氧自由基和细胞因子对其的损伤过程和机制。细胞因子TNF和反应性氧自由基如H₂O₂，O₂^-，OH-等均能导致血管病变，而这些病变首先表现为内皮细胞的损伤，同时也由于内皮细胞是炎性反应性病变入侵的第一道屏障，它的完整性和正常的功能对于限制和减弱炎症病变的发生有着重要的作用。因此，研究这些损伤因素是如何导致内皮的损伤失功以及具体的过程如何，是一个重要的基础课题。这将有望为临床上找到阻断其损伤的药物，达到治疗和预防疾病的目的。TNF和反应性氧自由基之所以能对内皮细胞的损伤而引发血管病变，主要是它们都能诱导多种转录因子启动不同的基因表达如内皮细胞黏附分子，凝血因子和基质蛋白，最终激活内皮细胞，从而破坏内皮细胞的屏障作用。尽管这两种损伤因子对内皮细胞有着共同的杀伤能力以及涉及的研究也非常广泛，但是它们在损伤的机制上，有着不同的细胞内信号传导通路。TNF主要启动TNF受体相关因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2），TRADD（TNFR1-associated death domain protein），使得AIP（ASK1 interacting protein）从原来的复合物释放，以它的C2区域重新和凋亡信号调节激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）的C端结合，激活ASK1的活性，激活后的ASK1使JNK（c-Jun N-terminal kinase）磷酸化，从而启动内皮细胞的凋亡程序。在此过程中，TNF也诱导一个蛋白酶抑制剂cycloheximide，阻断了由于TNF诱导的NF-κB依赖的生存基因的表达，从另一个方面加速了内皮细胞的凋亡。而反应性氧自由基如H₂O₂单独作用就足可以导致内皮细胞的死亡，它能激活JNK的活性，但不参与诱导NF-κB的活性。因此，应激活化的激酶如JNK能被TNF和反应性氧自由基激活，TNF的通路已较明确，但是反应性氧自由基如H₂O₂是通过怎样的信号传导通路还有待于进一步的深入研究。凋亡信号调节激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1），是丝裂原激活的蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase（MAPK） kinase kinase）家族的成员，位于JNK和p38 MAPK的上游并磷酸化激活它们。ASK1自身能被一系列炎症因子激活，如TNF，反应性氧自由基，死亡受体Fas，从而破坏细胞内微管结构，内质网蛋白聚集和细胞核的基因转录。体外研究结果表明活化的ASK1能启动多种生物学过程，包括不同细胞种类的凋亡，炎症，分化以及生存。根据以往的研究，ASK1基因缺陷的小鼠对于TNF和反应性氧自由基的损伤有耐受性和保护性，充分表明了ASK1在TNF和反应性氧自由基介导的凋亡途径中的重要作用。然而，TNF和反应性氧自由基是怎样使ASK1活化，其具体机制还有待于进一步的研究。这可能要从一些能与ASK1形成复合物并有相互关系的蛋白质开始入手研究。ASK1是一个分子量为170-kDa的蛋白质，根据不同的功能特点将其分为抑制性的N区段，内部激酶段，和调节性C区段。许多细胞内因子包括硫氧还原蛋白（thioredoxin），谷氨酰还原酶（glutaredoxin），以及小分子抑制性信号传递蛋白14-3-3能和ASK1结合形成复合物从而抑制ASK1的活性。TNF和H₂O₂之所以能激活ASK1的活性，较大程度上是将结合在ASK1上的抑制剂从复合物上脱落下来，解除其对ASK1的抑制作用。在TNF的作用下，ASK1的C端能与TNF受体相关因子2（TRAF2）结合形成复合物，这个结合是TRAF2能活化ASK1的先决条件。接着，ASK1上原先结合着的抑制性小分子硫氧还蛋白就从ASK1上脱落下来，解除了其对ASK1的抑制作用。同时TRAF2又诱导ASK1寡聚化，使其催化亚单位的活化环上Thr-845这个位点发生自磷酸化，从而激活了ASK1。活化的ASK1就启动了下游的级联反应，主要底物有MAP2K（MKK3／7 and MKK4／7）和MAPK（JNK and p38）。也就是说，TNF诱导下的ASK1通路上游下游都比较清楚，目前，H₂O₂能导致ASK1以及下游JNK激活，那么它上游的通路是一个怎样的过程，和哪一个蛋白质有关联，至今还是不清楚的。根据以往的研究，蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）家族通过介入多条信号传导通路参与调节各种生物学过程如细胞形态的变化，分化增生等等。到目前为止，蛋白激酶C有十多种同分异构体，根据它们的激活过程是钙依赖性还是甘油二酯依赖性或者两者兼有，PKC家族一共分成三组，经典型PKC（α，β，γ），新型PKC（μ，η，θ，δ，ε），和不典型性PKC（ζ，λ）。而蛋白激酶D1（Protein kinase D1，PKD1），也就是蛋白激酶Cμ，以前属于新型PKC的一种，但现在发现它在功能和结构，催化亚单位的序列，底物的特异性上有别于其他的PKC同分异构体，因此将其归类为和它性质类似的Ca²⁺／钙调素（calmodulin，CaM）依赖性激酶家族。PKD1的N端有pleckstrin homology（PH）区段而不象PKC那样有典型的自我抑制性假序列。最近的研究表明PKD1是细胞内不同信号传导通路的一个重要的调节因子。之所以设想把PKD1这样一个蛋白质引入H₂O₂-ASK1-JNK信号传导通路，是因为本研究的开端首次使用一系列药物，即特异性的蛋白激酶抑制剂，观察蛋白激酶在这个通路上是起作用的，抑制了PKD1的活性，也阻碍了信号的下传，并且也区分了TNF和H₂O₂诱导JNK活性的不同信号传导通路。G（?）6983和staurosporine是两种蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的特异性抑制剂，它们对于TNF或者H₂O₂诱导的JNK活性没有抑制作用。然而，G（?）6976和calphostin这两种药物，它们能抑制蛋白激酶D1（protein kinase D1，PKD1），实验发现，这两种药物能阻断H₂O₂诱导的JNK活性，但是却不能阻断TNF诱导的JNK活性。这个实验结果暗示着PKD1有可能介入H₂O₂诱导的JNK活性这个信号传导通路，并起着重要作用。同样地，也是H₂O₂能够将PKD1本身磷酸化，之后PKD1在细胞中的定位也发生了改变，从原先的细胞膜转到了细胞浆，并与定位在细胞浆的一个JNK的上游激活蛋白结合形成复合物，此蛋白名为凋亡信号调节激酶1（ASK1）。并且，PKD1是通过它的PH（pleckstrin homology）区段和ASK1的C末端进行结合的。而TNF却不能引发上述过程。运用RNA干扰的手段将PKD1的表达降低，同样也象抑制剂G（?）6976一样，能阻断H₂O₂诱导的ASK1-JNK信号途径，并大大减少了内皮细胞的凋亡。在作用机制的研究中，我们发现了PKD1上的自磷酸化位点Ser-205／208和Ser-219／223能和信号传递抑制性小分子蛋白14-3-3结合，这个结合成功与否正是决定PKD1介入H₂O₂诱导的ASK1-JNK信号途径的重要因素。抑制剂G（?）6976能阻断上述结合而G（?）6983却不能恰巧说明了这些关键的自磷酸化位点是PKD1介入上述通路的机制所在。而且，这些位点的突变导致PKD1和ASK1两个蛋白都不能形成复合物，当然，也不能激活JNK了。因此，本研究提出一个新的信号传导模型：蛋白激酶D1在H₂O₂的激活下磷酸化，从细胞膜移位到胞浆，和ASK1形成复合物，使ASK1的活性发生改变，因此原结合在ASK1分子上并抑制着其活性的信号传递抑制性小分子14-3-3从ASK1上脱落下来，而此时，PKD1通过它的几个自磷酸化位点成为了一个新的14-3-3受体，这些作用的结果导致了ASK1-JNK信号下传。材料与方法第一部分PKD1的表达和活性的改变对TNT和H₂O₂诱导的ASK1-JNK信号传导通路的影响1．培养传代BAEC（bovine aortic endothelial cell）细胞系；2．用几种不同的PKD1，PKC特异性抑制剂分别预处理BAEC，再用TNF或H2O2刺激；3．Western blot检测PKD1，ASK1，JNK的表达以及代表活性的磷酸化形式；4．免疫荧光法检测PKD1在TNF或H₂O₂刺激下的细胞内定位和迁移；5．用转染的方法将PKD1不同激酶活性的质粒在细胞内表达，Western blot检测下游反应；6．RNA干扰技术使得PKD1表达下降，以观察ASK1-JNK的信号改变。第二部分PKD1和ASK1相互作用形成复合物对ASK1-JNK通路的作用以及影响因素1．将构建的载体转染到BAEC细胞，并使之表达；2．免疫共沉淀检测PKD1和ASK1是否形成复合物；3．免疫荧光共聚焦检测PKD1和ASK1在细胞的定位。第三部分PKD1介入H₂O₂诱导的ASK1-JNK通路的机制研究1．GST Pull-down Assay：制备GST和14-3-3的融合蛋白，用于检测PKD1和14-3-3的结合情况；2．Site-directed mutagenesis方法使PKD1结合14-3-3位点突变，由丝氨酸变为丙氨酸；3．免疫荧光共聚焦检测PKD1的14-3-3结合能力改变和其在细胞定位迁移的关系。第四部分PKD1介导的H₂O₂-ASK1-JNK通路对内皮细胞的功能研究1．ASK1腺病毒的构建和表达2．细胞生存或死亡的量化结果一、PKD1介入H₂O₂诱导的ASK1-JNK信号传导通路1．H₂O₂能激活PKD1，而TNF不能激活PKD1；2．PKD1特异性抑制剂Go6976和Calphostin能抑制H₂O₂诱导的ASK1-JNK活性，而不能抑制TNF诱导的ASK1-JNK活性；而只能抑制PKC而不能抑制PKD1的药物Go6983和Staurosporin却不能抑制H₂O₂诱导的ASK1-JNK活性，当然也不能抑制TNF诱导的ASK1-JNK活性；3．PKD1的SiRNA减弱了PKD1的表达，同时也下调了H₂O₂诱导的ASK1-JNK活性；4．PH区段缺失的持续性活化的PKD1能上调H₂O₂-ASK1-JNK通路，而没有激酶活性的PKD1KW（Kinase dead）下调H₂O₂-ASK1-JNK通路。二、PKD1和ASK1相互作用形成复合物，共同传递信号1．PKD1的PH区段和ASK1的C端在分子结构上形成了一个复合物，它们的结合依赖于PKD1激酶活性；2．PKD1蛋白上14-3-3结合位点的突变导致PKD1不能与ASK1结合形成复合物；3．从细胞内的定位来看，PKD1和ASK1在H₂O₂的诱导下在胞浆形成复合物，有共定位现象。三、PKD1介入H₂O₂诱导的ASK1-JNK通路的机制与14-3-3蛋白有关1．PKD1与14-3-3蛋白结合的位点是在调节亚单位的S205／208和S219／223，PKD1激酶的活性与两者的结合有密切关系；2．抑制剂Go6976和Go6983对于PKD1首要激活位点S744／748的不同作用和对ASK1-JNK的抑制作用不协同；3．PKD1特异性抑制剂Go6976能抑制H₂O₂诱导的PKD1结合14-3-3蛋白的能力，而PKC抑制剂Go6983则不能抑制它们的结合；4．PKDS205／208A，PKD S219／223A使ASK1的14-3-3结合位点S967磷酸化水平增强，同时减弱ASK1下游JNK对H₂O₂的反应；5．PKD1结合14-3-3的能力下降同没有激酶活性的PKD1一样，均不能使PKD1在H₂O₂诱导下完成从细胞膜向细胞浆的迁移。四、PKD1介导的H₂O₂-ASK1-JNK通路对内皮细胞的功能研究1．抑制剂Go6976抑制内皮细胞凋亡而Go6983不能；2．PKD1的激酶活性与内皮细胞的凋亡呈正相关；3．PKD1SiRNA降低内皮细胞的凋亡。结论一、PKD1介入H₂O₂诱导的ASK1-JNK信号传导通路，能影响PKD1的因子均能平行地调节该通路。二、PKD1的PH区段和ASK1的C端在分子结构上形成了一个胞浆复合物，并受PKD1的激酶活性和14-3-3结合位点的影响。三、PKD1介入H₂O₂诱导的ASK1-JNK信号传导途径是通过PKD1和ASK1结合后，使14-3-3从ASK1上脱落，PKD1成为14-3-3的受体，从而激活ASK1，传递信号到下游蛋白。四、能减弱PKD1的蛋白质表达或抑制PKD1的激酶活性的干预措施能明显降低内皮细胞的凋亡，而如果使PKD1的活性提高，则内皮细胞的凋亡也随之增多。