论文部分内容阅读
原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见癌症，死亡率居国内恶性肿瘤第二位。目前手术切除、局部消融和肝移植是早期HCC三大根治性治疗手段，手术切除后肿瘤5年复发率大于70％。局部消融疗效可与手术切除相媲美，射频消融已广泛应用于不能手术切除HCC病人和等待肝移植病人的临床治疗，安全有效，并发症低于10％，然而，肿瘤消融后肝内复发率仍高达49％～60％。因此，迫切需要寻找新的途径治疗肝细胞癌复发。
免疫治疗因其免疫特异性而具有广泛应用前景。目前HCC免疫治疗的方法包括过继输入淋巴细胞、应用细胞因子(IFN-γ，IL-2和GM-CSF)、应用呈递自体肿瘤抗原(AFP多肽)的树突状细胞(DC)、应用自体肿瘤抗原联合GM-CSF，IL-2和BCG以及肿瘤消融结合瘤内注射细胞因子缓释微球的原位疫苗以激活机体免疫反应。这些措施临床应用表明可产生不同程度的免疫效应，影响肝癌病人的复发率和生存率。
射频消融是通过电极周围的组织离子高速振荡、摩擦而产生高热，导致肿瘤组织凝固性坏死。肿瘤消融过程中释放大量的细胞碎片，并伴有局部明显的T细胞浸润。另外，热消融能诱导抗原特异性T细胞反应。因而，射频消融产生的坏死肿瘤细胞有助于机体的免疫激活和肿瘤抗原的呈递，诱导机体发生肿瘤特异性T细胞反应。临床研究表明射频消融治疗肝癌产生的局部变化能激活肿瘤特异性T细胞反应，但这种效应不足以控制肿瘤复发，其机制目前尚不清楚。
调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)是一类CD4+CD25highFoxp3+T细胞，它不仅参与自身免疫性疾病、感染性疾病和移植耐受，而且通过抑制机体抗肿瘤免疫应答在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。研究表明HCC病人肿瘤组织和外周血中Treg数量增加，参与HCC的发生发展过程，影响HCC病人生存率与预后。消除Treg免疫抑制同时联合射频消融有望成为HCC免疫治疗的新方法，通过增强机体肿瘤特异性T细胞记忆反应以清除潜在转移灶和预防复发，提高HCC临床治疗疗效。
肿瘤引流淋巴结(tumor-draining lymph nodes，TDLNs)是直接位于肿瘤下游的第一站引流淋巴结，在肿瘤免疫中具有关键作用。TDLN是肿瘤抗原和肿瘤源性树突状细胞(DCs)首先进入的二级淋巴器官，因而认为TDLN是肿瘤抗原首次提呈给先天免疫系统的生理位点，是决定机体免疫激活抑或免疫耐受的关键初始部位。目前研究显示Tregs是TDLN内免疫耐受状态的重要因素。
本研究旨在探讨肿瘤引流淋巴结(tumor-draining lymph node，TDLN)内Tregs对局部免疫效应细胞的调节作用，进而影响肝癌热消融小鼠全身免疫状态的机制。
第一节 C57BL/6J小鼠肝细胞癌肿瘤引流淋巴结模型的建立
目的：建立肝癌肿瘤引流淋巴结(tumor-draining lymph node，TDLN)模型。
方法：Hepa1-6细胞培养传代2～3次后，收集细胞，每只小鼠右后肢足掌皮下接种20μL(6×105 cells)，观察肿瘤生长和成瘤率，每隔3 d测量肿瘤长径。接种后第12d获取TDLNs标本并称重。HE染色观察接种肿瘤和TDLNs病理学特点。
结果：小鼠足掌皮下接种成瘤率为80％(16/20)，第4 d可见足掌皮下肿瘤结节。足掌肿瘤侧的腘淋巴结(TDLNs)重量明显大于对侧腘淋巴结(0.0042±0.0002 g vs0.0007±0.0001 g,P＜0.01)。HE染色见肿瘤细胞排列不规则，多见病理性核分裂，TDLNs内淋巴细胞扩增。
结论：C57BL/6J小鼠足掌皮下接种Hepa1-6细胞能成功建立小鼠肝细胞癌TDLN动物模型。
第二节Tregs调节小鼠肝癌局部引流淋巴结免疫效应细胞功能
目的：探讨肿瘤引流淋巴结(tumor-draining lymph nodes，TDLNs)内调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)对局部免疫效应细胞的调节作用。
方法：建立小鼠肝癌TDLNs模型，通过免疫组织化学染色和流式细胞仪检测TDLNs内Foxp3+Tregs和CD4+及CD8+T细胞的数量。实时定量PCR测定Foxp3 mRNA表达水平。应用ELISPOT检测TDLNs内CD8+T细胞分泌IFN-γ的功能。
结果：TDLNs内Tregs和效应性T细胞均明显扩增，Tregs弥散分布于CD8+T细胞聚居区。TDLNs内Foxp3 mRNA表达水平显著高于同一接种肿瘤小鼠腹股沟淋巴结(P=.005)和脾脏(P=.000)。Tregs趋向于在TDLNs内聚集，而非其它外周淋巴结位点。荷瘤小鼠的脾脏Foxp3 mRNA表达明显高于注射LPS小鼠脾脏。Tregs抑制TDLNs内已初始化的CD8+T细胞分泌IFN-γ的功能，经anti-CD3封闭激活后，CD8+T细胞分泌IFN-γ的功能可恢复。
结论：TDLNs内Tregs通过抑制CD8+T细胞功能而发挥重要作用，清除Tregs是发挥特异性肿瘤免疫治疗的关键。
第三节肿瘤引流淋巴结内Tregs影响肝癌热消融小鼠脾脏CD8+T细胞功能
目的：探讨肿瘤引流淋巴结(tumor-draining lymph nodes，TDLNs)内调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)对肝癌热消融小鼠全身免疫状态的影响。
方法：建立小鼠肝癌TDLNs和肝癌热消融模型，通过免疫组织化学染色和流式细胞仪检测TDLNs和脾脏内Foxp3+Tregs和CD4+及CD8+T细胞的数量。实时定量PCR测定Foxp3 mRNA表达水平。应用ELISPOT检测TDLNs和脾脏内CD8+T细胞分泌IFN-γ的功能。
结果：TDLNs内Tregs和效应性T细胞均明显扩增，Tregs弥散分布于CD8+T细胞聚居区。TDLNs内Foxp3 mRNA表达水平显著高于同一接种肿瘤小鼠腹股沟淋巴结(P=.005)和脾脏(P=.000)。Tregs趋向于在TDLNs内聚集，而非其它外周淋巴结位点。荷瘤小鼠肝癌热消融后Tregs仍聚集TDLNs，而TDLNs中分泌IFN-γ的CD8+T细胞明显减少，同时脾脏内分泌IFN-γ的CD8+T细胞显著增加。
结论：TDLN内Tregs调控肝癌热消融小鼠脾脏内记忆CD8+T细胞功能而发挥重要作用，清除Tregs将可能提高肝癌病人热消融后肿瘤特异性T细胞记忆而控制肿瘤复发和转移。