目的： 1.了解LAMP(环介导恒温扩增)方法的技术原理，操作步骤。对环介导恒温扩增方法的各组分进行试验优化，找到该方法的最佳组分浓度和反应温度。 2.通过比较LAMP法，PCR法及传统检测方法对临床痰液标本中肺炎链球菌检测的结果，了解LAMP法的特点。评估LAMP方法应用于临床诊断，并成为一种临床快速检测痰液标本中肺炎链球菌的新方法的可能性。 3.采用荧光定量PCR技术检测痰液中的肺炎链球菌。获得该方法的标准曲线，得到痰液中肺炎链球菌DNA的浓度，建立一种快速检测痰液标本中肺炎链球菌的方法。 4.采用荧光定量PCR技术获得痰液标本中的肺炎链球菌的拷贝浓度，评估病人痰液中的肺炎链球菌DNA浓度与该菌是否为导致疾病的致病菌之间的可能关系，并以此来为临床是否对细菌室报送的肺炎链球菌阳性结果采取措施提供指导。 方法： 1.改变各种LAMP检测的相关试剂成分和反应温度，摸索最佳的浓度和比例以及反应温度。 2.采用LAMP法对多种标准菌株进行检测，验证该方法的特异性。 3.将肺炎链球菌标准菌株制得的总DNA进行系列梯度稀释，分别采用LAMP法和PCR法进行检测，比较两种方法的灵敏度。 4.采用LAMP法和PCR法对经过传统方法检测出肺炎链球菌的痰液和未检出肺炎链球菌的痰液标本各41例标本进行检测。观察LAMP方法检测临床痰液标本中的肺炎链球菌的效果。 5.对已知浓度的DNA标准品进行梯度稀释，使用荧光定量PCR商品试剂盒分别对其进行扩增，制得标准曲线，检测标本中的肺炎链球菌DNA浓度。 6.将痰液标本中的肺炎链球菌拷贝浓度与被检测病人临床诊断内容相结合，制作ROC曲线，判断肺炎链球菌的DNA浓度与病人标本中的肺炎链球菌的来源的可能关系。 结果： 1.通过对LAMP体系中的各组分进行优化，找到该反应针对肺炎链球菌检测的最佳各组分浓度和反应温度。包括1.6μmol/L的引物FIP和BIP，0.2μmol/L的引物F3和B3，8U Bst DNA聚合酶(附带含2 mM MgSO4的缓冲液)，1.0mM(each) dNTP，20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)2SO4，6mmol/L MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.8mol/L Betaine和5μl已制得的模板液，最后补双蒸水至50μl。反应条件为63℃60min进行扩增，80℃2min灭活酶的活性。 2.通过对9种非肺炎链球菌和2种肺炎链球菌的LAMP检测表明，非肺炎链球菌菌株不能通过该方法被检出，而肺炎链球菌则能够被检出。 3.对由标准菌株制得的已知浓度的细菌总DNA模板液进行梯度稀释后，进行LAMP法和PCR法检测发现，LAMP法在35min和60min时检测lytA基因的最低菌液浓度分别为103cfu/ml和102cfu/ml，而PCR法在30个循环的时间里检测lytA基因的最低菌液浓度为104cfu/ml。LAMP法(60min)比PCR法(30个循环)敏感性高二个数量级。 4.本研究共检测了82例痰液标本，其中41例用传统检测方法检出肺炎链球菌的标本用LAMP法和PCR方法也都能够检出。另外41例用传统检测方法没有检测到肺炎链球菌的标本中PCR法检测到了6例阳性，LAMP法检测到了13例阳性，x2=4.2312，P>0.1，三种检测方法没有显著差别。 5.对PCR产物进行纯化和浓度检测，将已知浓度的产物进行梯度稀释后分别进行PCR反应，得到了一条PCR扩增的标准曲线。 6.通过对病人的临床诊断和荧光定量PCR扩增的结果进行比较发现，在痰液肺炎链球菌拷贝浓度为103-109/ml之间时，病人呼吸道疾病的病情存在较大的轻重差异。通过对结果的ROC曲线分析发现，最佳的截断值是2.95×105/ml，在此时其灵敏度是85.7％，特异性是76.9％。 结论： 1.环介导恒温扩增方法检测肺炎链球菌的方法具有可行性，而且该方法的特异性和灵敏度均较好，在痰液标本制得的总DNA溶液复杂成分条件下也能够取得成功。 2.我们将LAMP法、PCR法及传统方法对82例痰液标本中肺炎链球菌的检测结果进行比较后发现，三种方法没有显著性差别。但是LAMP方法具有的检测快速，成本低等优点较其它两种方法仍有很大的优势。可以对此种方法进一步研究完善，以满足真正用于临床应用的要求。 3.采用荧光定量PCR对痰液标本进行肺炎链球菌定量检测的尝试被证明是可行的。在对PCR体系和温度进行充分优化，并对引物的特异性进行充分验证的情况下，该方法在进行检测的过程中没有发现非特异性扩增的现象，引物的特异性是可以信赖的。 4.通过对荧光定量PCR的结果和病人病历的分析发现，当痰液中的细菌DNA浓度达到2.95×105/ml及以上时应该高度怀疑检出的肺炎链球菌为致病菌而非暂居菌。