环境内分泌干扰物污染，尤其是环境雌激素类污染物（Environmental Estrogens）污染，因其对人类健康的影响最广，危害最大，被认为是继“温室效应”和“臭氧层破坏”之后的又一严重的全球性环境公害问题。因其种类多，分布广，难降解，环境存留期长，且会通过食物链逐级累积放大，具有很强的致癌、致畸与致病性，直接威胁着人类社会与生物圈的生存与繁衍。17β-雌二醇作为天然雌激素类污染物的主要成员，对生物体具有很大的危害。因此如何治理环境中雌激素物质的污染、降低其危害已被列为环境治理与预防医学领域的研究重点。近年来，微生物降解因其降解效率高和无二次污染等优势，被认为是去除环境雌激素的主要与有效手段。从环境中分离获得的微生物菌株或菌群，可利用雌激素类物质作为碳源或营养物质，经过复杂的生理代谢，最终将其完全分解为无害的终产物。目前已有多种菌株被证实具有雌激素降解能力，但是由于降解效率不理想，遗传背景不确定，基因组信息缺乏，代谢机制不清晰，直接限制了微生物修复雌激素污染的进程。　　本课题围绕我们从污水处理厂活性污泥中富集分离的一株可利用雌激素类物质的微生物菌株SJTE-1开展，从其理化性质与进化地位、雌激素降解利用效能、全基因组序列与比较蛋白组学几个方面进行了研究：确定了菌株 SJTE-1的进化地位，检测了其利用17β-雌二醇（E2）生长的性质及其降解效能；利用GLX-454平台和Illuminia测序平台，测定了该菌株的全基因组序列并进行了比对分析，预测了一系列可能参与雌激素降解的基因；利用同位素相对标记与绝对定量技术（iTRAQ技术），测定了菌株SJTE-1在17β-雌二醇环境下和营养丰富条件下的蛋白组学，并进行了比较与分析。最后，利用Tn转座子突变技术，对该菌株进行了随机突变与筛选。主要内容如下：　　1.菌株SJTE-1的分离鉴定与雌激素降解效能分析　　利用17β-雌二醇富集培养分离获得的菌株SJTE-1，理化性质分析显示其为革兰氏阴性菌，菌落质地柔软，扁平，乳白色，半透明，表面光滑而有光泽度，边缘呈圆形，且散发出浓烈的腥臭味；最适生长温度为30?C。16S rRNA基因扩增测序比对结果表明，菌株SJTE-1与假单胞菌属（Pseudomonas）的16S rRNA基因序列具有极高的同源性与相似性（>99％）；系统进化树比对结果证实其与恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的遗传距离最近，为恶臭假单胞菌。　　利用全自动生长曲线测定仪，对菌株SJTE-1以不同浓度的17β-雌二醇为单一碳源生长的情况进行实时监测。生长曲线结果显示，菌株SJTE-1可耐受和利用高达100 mg/L的17β-雌二醇，其生物量与雌激素浓度呈现正相关，雌激素浓度增加会延长细菌生长的平台期。之后，我们利用超高效液相色谱技术测定了菌株降解不同浓度雌二醇的降解效率，结果表明24小时内菌株SJTE-1可将1 mg/L的17β-雌二醇完全降解；七天内该菌株可完全分解高达25.0 mg/L的E2，对100 mg/L的17β-雌二醇降解效率也可达80%以上，远远高于已报道的其它菌株的效能。进一步对其代谢产物的分析显示，17β-雌二醇首先被菌株SJTE-1分解成为雌酮（E1）后，再被其降解为无雌激素活性的终产物。因此，菌株SJTE-1具有很高的雌激素降解效能与雌激素耐受性，降解周期短，降解产物无二次污染，可作为环境生物修复的候选菌株。　　2.恶臭假单胞菌SJTE-1全基因组序列测定与分析　　利用GLX-454平台和Illuminia测序平台，我们测定并分析了恶臭假单胞菌SJTE-1的全基因组序列。菌株SJTE-1的基因组总长5,551,505 bp，GC含量为62.25%，含有4,915个编码基因，1个16S-23S-5S操纵子，52个 tRNA；其编码的蛋白功能涉及到各个代谢途径，包括跨膜转运，胁迫反应，核酸代谢，蛋白代谢，芳香族化合物代谢，辅因子等。序列比对与预测结果显示，菌株SJTE-1的基因组中包含多个可能编码激素分解酶的同源基因，包括短链脱氢/还原酶，乙酰辅酶A脱氢酶，烯酰基-酰载体蛋白还原酶，3-氧酰基-酰基载体蛋白还原酶等，这些基因可能与雌二醇的降解直接相关。因此，全基因组序列的测定与分析的完成明确了菌株 SJTE-1的遗传信息，将有助于推进其降解基因与降解机制研究。　　3.恶臭假单胞菌SJTE-1比较蛋白质组学研究　　蛋白质组学通过测定不同条件下细胞内蛋白的表达水平，可确定细胞整体的代谢机制变化。在恶臭假单胞菌SJTE-1的全基因组序列测定完成后，利用iTRAQ技术，我们对菌株SJTE-1在17β-雌二醇为单一碳源培养条件下的整体蛋白表达情况进行了定性与定量分析，并与其在葡糖糖培养条件下的蛋白表达情况进行了比较。结果表明，在17β-雌二醇培养条件下，有78个蛋白表现出有显著差异（p<0.05），其中45个蛋白明显上调，33个蛋白发生了明显下调。这些差异表达蛋白涉及胁迫回应，碳源摄取，胞内转运，能量代谢，核酸代谢及转录翻译等过程。表达上调的蛋白多集中在对碳源的摄取与胞内转运，相关核糖体蛋白的表达及能量代谢相关蛋白；而表达下调的蛋白多与葡萄糖识别及其代谢相关。这说明菌株SJTE-1在以17β-雌二醇为碳源生长时，会相应提高与之相关的代谢途径及能量需求。因此，这一比较蛋白质组学结果初步明晰了菌株SJTE-1代谢雌激素的整体网络，为后续降解关键基因与调控基因的鉴定指明了方向。　　4. Tn5转座子随机突变　　为了确定参与雌激素降解的基因，我们利用Tn5转座子随机突变方法对恶臭假单胞菌SJTE-1进行突变，根据其雌激素降解效能缺失与抗生素抗性情况进行筛选。共筛选获得了56株突变株，它们可在丰富培养基中正常生长，但不能在以雌二醇为单一碳源的无机盐培养基中生长，说明这些突变株的雌二醇降解能力受影响，Tn5插入的基因可能是参与雌二醇分解的关键基因。但对Tn5插入位点的反向测序结果未发现有效的基因信息，即其序列与已报道的雌激素降解基因或组学方法预测的潜在降解基因之间无重叠。后续我们将对突变株进行全基因组扫描来确定其Tn插入位点，最终确定菌株SJTE-1中雌激素降解的关键基因。　　综上所述，本课题富集分离了一株新的具有实际应用潜能的环境雌激素降解菌株SJTE-1，利用分子生物学技术和组学技术，对其降解效能、全基因组学和比较蛋白组学进行了研究，并对其降解分子机制进行了初探。结果显示恶臭假单胞菌SJTE-1可耐受高浓度雌二醇，降解效率高，降解周期短；其基因组中包含了多个潜在的雌激素降解基因，在雌二醇为单一碳源环境下，菌株SJTE-1胞内的多个涉及到胁迫回应，碳源摄取，胞内转运，能量代谢，核酸代谢及转录翻译等过程的蛋白的表达水平均发生了显著性变化。本课题的完成将有助于推动环境雌激素生物修复的应用及降解菌株代谢机制的研究，具有重要的理论意义与实际应用价值。