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原癌基因Pleiotrophin(Ptn)、抑癌基因Pten是与乳腺癌发生、发展相关的两个基因。Pten基因是第一个具有磷酸酶功能的肿瘤抑制基因,其在肿瘤中的突变频率与著名的p53基因相当,Pten编码的蛋白具有调控细胞周期,促进细胞凋亡,抑制肿瘤转移等多种生物学功能,分别是通过对P13K/Akt,MAPK,FAK等信号转导通路的协同调节来实现。Ptn是一个氨基酸序列极为保守的原癌基因,在胚胎期组织中表达,很少表达于成年正常组织中,但可以在包括乳腺癌在内的多种肿瘤细胞系和肿瘤组织中存在;具有促进血管生成、细胞转化、抗凋亡、促有丝分裂等与肿瘤侵袭性生长有关的特性。 本课题组既往的研究发现,Ptn在两种不同的PTEN缺失的胚胎成纤维细胞系中高表达,并且其功能同PTEN基因敲除小鼠的表型有相符之处,Ptn在乳腺特异缺失PTEN的小鼠模型的乳腺癌组织中高表达。 为了阐明Pten基因与乳腺癌的关系,及其是否具有调控Ptn的能力?是否通过Akt发挥其调控作用的?本研究首先检测了中国人乳腺癌组织中Pten基因的突变和表达情况,结果发现45例乳腺癌新鲜组织中,存在1例位于第2外显子的错义突变;31.3%(14/45)存在Pten启动子CpG岛的甲基化改变,其中64.3%(9/14)PTEN蛋白表达缺失,50%(9/18)PTEN表达缺失的乳腺癌存在Pten启动子甲基化;而10例乳腺癌癌旁正常组织均未检测到Pten基因突变和启动子区的甲基化;在146例乳腺癌石蜡包埋组织中,发现PTEN表达与原发肿瘤大小、肿瘤临床分期、PTEN表达与ER、PR表达相关,PTEN表达与乳腺癌预后有一定关系,其表达为(+++)者无病生存率明显高于阴性及+~++者,并且,ER、PTEN同时表达的预后明显优于仅一项表达或均未表达者,但多因素分析PTEN表达最终未进入方程。 随后,我们对Ptn启动子进行了生物信息学分析,通过NCBI网站中Unigene确认了转录起始点,采用PCR扩增的方法对小鼠与人的Ptn基因的启动子分别进行克隆,构建至荧光素酶报告载体(pGL3-Basic)转染至293或3T3细胞,Dual-GloTM荧光素酶检测系统测定发光强度,确定其启动子区在小鼠为-1099/+11(1109bp),人Ptn启动子区为-998/+73(1070bp)。然后采用PCR的方法获得小鼠Ptn启动子的系列截短突变体,