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弓形虫(Toxoplasma gondii, T. gondii)和新孢子虫(Neospora caninium, N. caninum)都是专性细胞内寄生原虫,同属顶复亚门,二者在形态学特征和生物学特性上有许多相似之处,但是它们对小鼠的急性毒力却存在显著差异。许多研究已经表明弓形虫棒状体蛋白18(T. gondii rhoptry protein18, TgROP18)是其最重要的毒力因子,介导了弓形虫Ⅰ型强毒株与Ⅲ型弱毒株的毒力差异。本研究通过生物信息学分析发现新孢子虫棒状体蛋白18(N. caninum rhoptry protein18, NcROP18)的基因序列中插入了多个终止密码子,不能表达相应的功能蛋白,是一个假基因。因此,我们推测弓形虫与新孢子虫ROP18的差异可能是导致它们急性毒力差异的重要因素。基于上述原因,我们开展了如下研究。首先将弓形虫Ⅰ型虫株RH株的TgROP18定向克隆至pDMG表达载体,构建了以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因、乙胺嘧啶抗性基因CDHFR-TS)为筛选标记的pDMG-TgROP18-GFP转染质粒。通过电转化方法将质粒转入新孢子虫Nc1株,经过乙胺嘧啶筛选和流式细胞仪分选获得阳性单克隆虫株。通过PCR、qRT-PCR及Western-blot对阳性单克隆虫株进行鉴定,证实表达TgROP18的转基因新孢子虫构建成功,为下一步研究转基因新孢子虫的表型特征及验证ROP18是否为弓形虫与新孢子虫毒力差异的关键因子奠定了基础。通过细胞培养观察、噬斑实验(Plaque assay)、Transwell实验、Gliding motility实验、细胞入侵实验及细胞内增殖实验,对转基因新孢子虫和新孢子虫野生株及弓形虫野生株的表型进行了比较研究,结果显示转基因新孢子虫的运动能力及入侵细胞的能力没有发生明显改变,但其在细胞内的增殖能力较新孢子虫野生株显著增强,与弓形虫在细胞内的增殖能力非常接近。这些结果提示转基因表达的TgROP18可能会增强新孢子虫的毒力。通过小鼠感染实验对转基因新孢子虫和新孢子虫野生株及弓形虫野生株的毒力进行了比较研究,结果显示转基因新孢子虫对小鼠的毒力稍弱于弓形虫野生株,但是较新孢子虫野生株显著增强,说明转基因表达的TgROP18可以显著增强新孢子虫的毒力,从而证实了弓形虫与新孢子虫ROP18的差异是导致它们急性毒力差异的关键因素之一。为了进一步研究转基因新孢子虫毒力增强的机制,我们进行了IRGs募集实验和磷酸化检测,结果表明转基因新孢子虫和弓形虫RH株一样,通过TgROP18的磷酸化作用阻止IRGs向其纳虫空泡膜募集,以抵抗宿主细胞的免疫杀伤作用,从而导致其对宿主的毒力增强。PCR及Western-blot结果显示转基因新孢子虫的棒状体蛋白5(N. caninum rhoptry protein5,NcROP5)的表达量较野生株显著提高,IFA结果显示NcROP5与外源转入的TgROP18共定位,这些结果都提示NcROP5可能发挥调控转基因表达的TgROP18的功能。综上所述,本研究首次对弓形虫与新孢子虫毒力差异的分子机制进行了探索研究,确定了ROP18是弓形虫与新孢子虫毒力差异的关键因子之一,也揭示了新孢子虫和弓形虫之间存在着更紧密的亲缘关系,为进一步研究弓形虫与新孢子虫的致病机制和系统发生提供了理论依据。