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肿瘤微环境(tumor microenvironment)即肿瘤细胞周围的环境,主要由成纤维细胞、胶质细胞、免疫细胞和血管内皮细胞等组成。肿瘤微环境中,巨噬细胞等免疫细胞对肿瘤的发展、转移具有重要的调控作用。
肿瘤微环境中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages,TAM)。细胞表型学研究发现:这类细胞高表达甘露糖受体、清除剂受体、Ⅰ型诱导型精氨酸酶、选择素CCL12和CCL17等。功能研究表明,TAM主要高表达抑炎因子IL-10,而低表达促炎因子IL-12、IL-23、TNF-α等。TAM在促进肿瘤血管新生、组织修复、辅助Tht2细胞应答等方面起到关键的正向调控作用,其活化方式以替代活化(alternative activation)为主。
肝脏是个性别二态性的器官,性别能够直接影响肝脏的生理、病理状态。肝细胞癌(Heoatocdlular carcinoma,HCC)发生发展过程具有明显的性别差异现象。流行病学调查发现:男性发病率约是女性的3.5倍;临床研究数据表明,男性中HCC预后较女性差。但HCC性别差异的内在机制不明,特别是肿瘤微环境在其中的作用亟待揭示。
在本实验室前期工作中,我们已在动物原位肝细胞癌模型中发现:雄鼠和雌鼠HCC发展趋势有显著差异,雌鼠HCC恶性发展状态明显弱于HCC雄鼠,雌鼠肝肿瘤组织中TAM浸润程度低于雄鼠。补充雌激素可以减轻这种性别差异。基于这一重要发现,本研究立足于从雌激素对巨噬细胞活化及功能调控的角度,探讨肝细胞癌发展性别差异的机制,主要工作及结果包括:
1.原位HCC动物模型构建:构建小鼠原位HCC模型,基于此进一步通过卵巢摘除、睾丸摘除及皮下注射外源性雌激素的方法,建立HCC性别差异研究模型。动物生理学指标分析发现:荷瘤雄鼠生存期短于荷瘤雌鼠;肝细胞癌生长在雄性小鼠与雌性小鼠间存在性别差异,雄鼠肿瘤重量和体积明显大于雌鼠;雌鼠经卵巢摘除手术后肿瘤恶化程度增加,补充生理浓度的雌激素可以抑制肿瘤生长。
2.原位肿瘤组织区TAM浸润分析:原位肝细胞癌组织切片H&E染色的结果显示,雌激素可以抑制炎性细胞的浸润,促进薄层纤维组织的生成,改善肿瘤细胞的浸润性生长。原位肝细胞癌组织切片免疫荧光组织化学检测发现:雌性小鼠肿瘤部位TAM细胞的浸润及替代活化较雄性小鼠明显减少,而补充生理浓度的雌激素可以有显著抑制肿瘤部位TAM细胞的浸润及替代活化。
3.异位HCC动物模型构建及肿瘤组织区TAM浸润分析:构建小鼠皮下荷瘤模型,并进一步进行小鼠卵巢摘除、睾丸摘除手术及皮下注射外源性雌激素,建立异位荷瘤性别差异研究模型。动物生理学指标分析发现:雄性小鼠中的肿瘤体积平均水平大于雌性小鼠的肿瘤,补充雌激素可以抑制肿瘤生长。异位肿瘤组织切片H&E染色的结果显示:雄性小鼠与雌性小鼠的肿瘤细胞形态、浸润行为、炎性细胞招募及巨噬细胞浸润并无显著差异。免疫荧光组织化学检测发现:雌激素对肿瘤组织中巨噬细胞的浸润无明显改变,但在巨噬细胞替代活化上表现出了较显著的抑制作用。
4.雌激素介导的巨噬细胞替代活化的信号转导及分子机制(1)建立巨噬细胞替代活化模型:在小鼠巨噬细胞株ANA-1及RAW264.7中,用IL-4诱导使巨噬细胞发生替代活化,成为表型为M2(alternative activatedmacrophage)的细胞。运用荧光染色及流式细胞仪分析检测M2细胞表面标志分子CD206、酶活检测方法测定精氨酸酶活性,筛选出小鼠巨噬细胞株ANA-1作为后续研究M2分化的模式细胞株。
(2)构建肿瘤细胞一巨噬细胞共培养模型:将三种小鼠肿瘤细胞株H22、Hepal-6、B16-F10分别与ANA-1在transwell细胞培养小室中共培养24 h。流式细胞仪分析及酶活检测发现:与肿瘤细胞共培养的ANA-1发生了明显的替代活化,表现为CD206的表达上调及精氨酸酶活性的提高。
(3)雌激素调控的巨噬细胞替代活化的功能指标及信号转导机制:在M2模型及与肿瘤细胞共培养模型中,用10 nM(相当于孕期生理浓度)雌激素处理。肿瘤细胞迁移力分析发现巨噬细胞促肿瘤细胞的迁移力降低;CD206表达及精氨酸酶活性分析显示,巨噬细胞的替代活化受到明显抑制;IL-10释放量及IL-10与IL-12释放的比值降低。通过运用雌激素受体的特异性激动剂PPT及DPN,亦发现DPN具有与雌激素相同的抑制巨噬细胞向M2活化的作用。分子生物学实验的结果显示:雌激素明显调控了JAK1/STAT6信号通路,表现为其有效抑制巨噬细胞中JAK1和STAT6的磷酸化,而对于其他激酶(例如JNK1/2)无显著的抑制作用;雌激素显著增强JAK1/STAT6信号通路上游调控因子SOCS1的mRNA表达,但对SOCS3、SHP1、SHP2 mRNA表达无明显作用;雌激素对IL-4受体CD124的表达水平无明显调控作用,我们的结果初步说明:雌激素不是通过IL-4受体分子来调控下游JAK/STAT6通路的信号传递,而是通过正向调控JAK1/STAT6通路的负调控因子SOCS1的表达,从而抑制了巨噬细胞向替代活化的功能状态转化。分子水平的实验提供了我们进一步工作的必要信息与数据,使我们可以围绕SOCS1分子网络研究其对巨噬细胞替代活化功能调控及在肿瘤微环境中的作用。
综上所述,本研究首先在小鼠原位肝细胞癌性别差异模型中发现了肿瘤相关巨噬细胞替代活化与HCC发展的性别差异密切相关,然后通过动物皮下荷瘤模型进行了验证。基于动物实验中肿瘤生物学分析及TAM活化及功能研究,我们进一步在分子水平探讨了雌激素对巨噬细胞替代活化的相关信号转导通路。本工作的创新在于首次发现了肝肿瘤微环境中巨噬细胞替代活化的重要调控功能,并将其与HCC性别差异联系起来。由此提出了HCC中“TAM替代活化性别差异”假说,为下一步基于TAM分子调控的系列工作奠定了基础。