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虾青素是一种次生类胡萝卜素,具有超强的抗氧化性,在生物体内能淬灭单线态氧、清除自由基,可以防止机体衰老,增强免疫力。同时还具有抗癌抑癌、预防心血管疾病等生物学功能,广泛应用于食品、医药和保健品等行业。小球藻含有虾青素,具有生长速度快、生物密度高、易培养等优点,是很好的生物反应器。但是小球藻中虾青素含量低,应用基因工程的方法提高虾青素含量成为近年来研究的热点。农杆菌具有操作简单、转化效率高、经济实用等优点,近年来广泛应用于藻类的遗传转化。本研究建立农杆菌介导的小球藻遗传转化的方法,构建β-胡萝卜素酮化酶基因表达载体,并通过农杆菌介导的方法转入小球藻中,提高虾青素含量。本论文具体研究内容和成果如下:1、筛选体系的确定:研究羧苄青霉素对农杆菌和小球藻的影响,羧苄青霉素浓度为200mg/L时抑制农杆菌的生长,羧苄青霉素对小球藻生长无影响。研究小球藻在BBM液体培养基和固体培养基中对G418的敏感性,确定在BBM液体培养中G418的筛选浓度为1mg/L;在BBM固体培养基中G418的筛选浓度为2mg/L。最终确定BBM液体培养基中G418浓度为1mg/L和羧苄青霉素浓度为500mg/L的小球藻筛选体系;在固体培养基中G418浓度为2mg/L和羧苄青霉素浓度为500mg/L的小球藻筛选体系。2、以GFP为报告基因,以G418抗性基因(NPT II)作为筛选标记基因,CaMV35S为启动子,PBI121为载体,利用农杆菌介导转化的方法,建立小球藻遗传转化体系。通过PCR验证,GFP基因在小球藻内完成基因重组;通过RT-PCR验证,GFP基因成功转录;在激光共聚焦下转化子显示绿色荧光,GFP基因成功翻译。转化200天后,阳性鉴定依然为阳性,GFP稳定遗传表达。3、构建PBI121::35S::PDSSP-BKT载体。PDSSP为调控八氢番茄红素的信号肽基因,BKT为β-胡萝卜素酮化酶基因,先通过overlap PCR技术克隆获得PDSSP-BKT融合基因。4、利用农杆菌介导转化的方法,将PDSSP-BKT融合基因转入小球藻,并筛选阳性转化子,提取虾青素,通过HPLC测定,在相同培养条件下,转化子中虾青素含量比野生型高63.5%。