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研究背景与目的根据WHO的标准定义,不育是指夫妻同居一年以上,在未采取主动避孕而致女方不能怀孕的情况。近年来,随着工业化进程的加速,人们的生活方式也在发生改变,如过重的心里压力、不健康的饮食、恶化的环境等因素均可导致夫妻不孕不育,这一现象已引起社会的高度关注。目前,男性不育约占整个人类不孕不育的40%,但其发病原因及其机制尚不清楚。研究表明,FK506通过抑制钙调磷酸酶(calcineurin)活性,可引起未成熟精子的中端僵化,从而导致雄性小鼠不育。FKBP12.6是FK506结合蛋白家族中的一个重要成员,研究表明,该蛋白可与FK506结合,即可通过直接抑制calcineurin活性发挥免疫抑制作用,同时又可通过调节钙离子释放通道(ryanodine receptor 2,RyR2)而调控calcineurin活性。因此,本课题借助FKBP12.6敲除小鼠,旨在研究FKBP12.6在FK506所致雄鼠不育过程中的作用及其机制,从而为治疗男性不育提供新的靶点。方法与结果1.敲除FKBP12.6基因可明显缓解FK506引起的成年雄性小鼠不育:为了确定FKBP12.6在FK506所致雄鼠不育中的作用,我们首先将成年野生型(WT)和FKBP12.6基因敲除(FKBP12.6KO)雄性小鼠皮下注射FK506,结果显示,给予WT小鼠FK506后,精子发生中端僵化,受精比率急剧下降,而FKBP12.6KO鼠给药后与WT相比精子中端僵化明显减少,受精情况显著改善。结果表明FKBP12.6缺失在FK506所致雄鼠不育过程中起重要保护作用。2.FKBP12.6在睾丸组织内质网高表达:睾丸是精子发生的场所,为了明确FKBP12.6或FKBP12在雄性成年鼠睾丸中对精子发生发育的影响,我们分别提取雄性小鼠的睾丸总蛋白和微粒体(microsome,主要为内质网蛋白),并检测其表达情况。Western blot检测,结果显示:虽然FKBP12在睾丸中的表达较FKBP12.6更为丰富,但FKBP12.6在内质网上的相对表达量显著高于FKBP12。表明FKBP12.6在睾丸钙离子调控中可能起重要作用。3.FKBP12.6抑制睾丸特异性calcieneurin(PPP3CC/PPP3R2)活性:有研究表明,calcineurin的PPP3CC/PPP3R2亚基在睾丸组织特异性表达。为了进一步明确FKBP12.6和FKBP12对睾丸calcineurin活性的影响,我们首先采用体外原核细胞系统表达和纯化小鼠GST-FKBP12.6和GST-FKBP12融合蛋白,并通过亲和层析实验(pull down)观察FKBP12.6和FKBP12蛋白与睾丸组织裂解液或体外纯化的PPP3CC/PPP3R2蛋白的特异性结合。结果显示FKBP12.6与睾丸PPP3CC/PPP3R2蛋白的结合能力显著高于FKBP12,提示FKBP12.6在FK506抑制睾丸calcineurin活性过程中可能起主要作用。结论:我们的研究表明,FKBP12.6缺失可明显减轻给予FK506引起的雄性成年鼠不育,其机制可能与其在睾丸组织上表达缺失,解除了FK506对成年雄性鼠睾丸calcineurin活性的抑制,进而促进精子的正常发育有关。