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RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指双链RNA特异性地诱发与其序列同源的mRNA分子被降解，从而抑制基因表达的现象，是一种特殊的转录后基因表达沉默(posttranscriptionalgenesilence，PTGS)现象。近年来在细胞和动物体系中利用小干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)进行的抗肿瘤和抗病毒等的应用研究表明，RNA干扰技术在疾病治疗领域具有诱人的应用前景。本实验室曾报道利用大肠杆菌发酵制备esiRNA(endoribonuclease-preparedsiRNAs)，并利用其在细胞体系中高效特异地抑制了乙型肝炎病毒的复制。本论文首先在以前的工作基础上改进了在大肠杆菌中表达双链RNA的表达载体的构建方法，提高了双链RNA的产量：进一步我们针对乙型肝炎病毒的不同基因制备了四种esiRNA，通过实验筛选出具有最佳抑制效率的esiHBVP，并且证明esiHBVP对乙型肝炎病毒的抑制效率高于化学合成的小干扰RNA；最后通过实验我们还证明了来自C型乙型肝炎病毒的esiHBVP能够高效抑制靶序列不完全一致的报告基因的表达，来自B型乙型肝炎病毒的esiHP9同样可以高效特异地抑制靶序列一致性为87％的C型乙型肝炎病毒的复制。结果显示esiRNA可以耐受一定程度的靶序列变异而不影响其抑制效率，我们推测esiHBVP能够抑制在中国人群中占主导地位的B型和C型乙型肝炎病毒的复制。
论文第一章的工作中，改进了在大肠杆菌中生产双链RNA的表达载体的构建方法以及estRNA的纯化方法，在细胞体系中证明了利用这种方法纯化得到的esiRNA不激活干扰素途径，不引起非特异性基因表达的抑制。首先构建了一个带有间隔序列的表达载体，然后将目的基因分别以正向和反向连接到间隔序列的两侧，使得目的基因的正反义链在同一强启动子调控下被转录，互补配对后形成双链RNA。构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达双链RNA，与双启动子表达载体相比，双链RNA的得率提高了约5倍。利用大肠杆菌RNaseⅡI对双链RNA进行酶切，酶切产物通过离子交换层析和分子筛层析分离纯化，最终得到21bp左右的esiRNA。细胞实验结果显示esiRNA可以高效特异地抑制目的基因的表达。
第二章的工作中，证明了esiRNA比化学合成的siRNA能够更加高效地抑制乙型肝炎病毒的复制。针对HBV的不同ORF制备了4种esiRNA，在HepG2细胞中筛选出对HBV抑制效率最高的esiRNA—esiHBVP，并且检测了esiHBVP在动物体系中对HBV的抑制情况。然后合成了一段文献报道的对HBV抑制效率最好的siRNA，在细胞体系中比较了esiHBVP和合成的siRNA对靶基因表达的抑制情况，同时在动物体系中比较了esiHBVP和合成的siRNA对乙型肝炎病毒复制的抑制情况。在CHO细胞中，48小时的实验结果显示esiHBVP对报告基因HBsAg表达的抑制作用高于合成的siRNA。通过尾静脉液压法给药esiHBVP和合成的siRNA，观察它们对乙型肝炎病毒在ICR小鼠肝脏内复制的抑制作用，与没有注射小干扰RNA的对照小鼠相比，两种siRNA处理的小鼠肝脏内的乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原、C抗原的表达水平均被抑制，esiHBVP的抑制效率高于合成的siRNA。注射后的第一天，esiHBVP和合成的siRNA对HBsAg的抑制率分别为90％和33％，对HBeAg的抑制率分别是89％和45％。在第四天，与没有注射小干扰RNA的对照小鼠相比，1μgesiHBVP处理过的小鼠血清中的病毒DNA拷贝数下调了82％，而1μgsiRNA处理过的小鼠血清中的病毒DNA拷贝数仅下调了37％。结果表明，与合成的siRNA相比，esiHBVP在抑制效率和持续时间方面均显示出明显的优越性。
第三章的工作中，从血清中扩增HBVP基因片段，将这些具有不同程度序列一致性的HBVP片段构建到报告基因的3’非翻译区，作为esiHBVP作用的靶序列，在CHO细胞中检测esiHBVP对它们的抑制情况。结果表明esiHBVP可以同样高效特异性地抑制含有不同程度变异的靶序列的报告基因的表达。在此基础上，我们制备了和HBVP序列差异最大的片段HP9对应的esiRNA--esiHP9，分别在细胞体系和动物体系中检测了esiHP9对与其序列一致性为87％的乙型肝炎病毒的抑制情况。在HepG2细胞中，esiHP9能够剂量依赖性地抑制乙型肝炎病毒表面抗原的分泌表达，在用量为150ng时，esiHP9达到和esiHBVP基本一致的抑制效率。在单次转染150ngesiHP9后，抑制率在以后的7天内维持在80％左右。通过尾静脉液压法给药观察esiHP9抑制乙型肝炎病毒在ICR小鼠肝脏内的复制时，与没有注射小干扰RNA的对照小鼠相比，esiHP9和esiHBVP对小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的抑制效率基本相同。由此可见esiRNA可以耐受一定程度的靶序列变异而不影响其抑制效率。这种特性使得esiRNA一方面可以用于防止突变株的产生，另一方面可以有效抑制已经存在于乙肝患者体内的不同基因型的病毒的复制，体现出相对于单一序列siRNA的优越性。