本研究所的研究方向之一为基于神经退行性疾病的小分子化合物的化学生物学研究,本课题是上述研究方向的一部分工作。本课题分为两部分:第一部分工作是国家自然科学基金项目“三七脂溶性成分及其对神经细胞的营养和保护作用研究”(No30371731)和“人参炔醇和人参环氧炔醇神经营养作用机制的研究”(No30672441)工作的深入,开展对天然脂溶性小分子化合物人参炔醇(PNN)的抗低氧的活性研究；第二部分工作是上述工作的延伸,我们在国家自然基金项目“大麻素受体内源性配基新型类似物的神经保护作用及其机制”(No30873057)和上海市科委基础重点项目“活性Elmiric acid(EMA)家族化合物的发现及神经保护作用”(No08JC1413600)资金的支持下,开展对自主合成的AEA类似物硬脂酰酪氨酸(NsTyr)的神经保护活性及机制的研究,并探索NsTyr的作用靶点,为治疗某些神经系统疾病寻找AEA类似物的候选化合物。　　 第一部分人参炔醇通过上调HIF-1α对抗OGD诱导的神经元损伤　　 缺血及缺血/再灌损伤最终会导致神经元凋亡,低氧诱导因子HIF-1α和其它诸多细胞因子一样可以调节低氧引起的细胞凋亡。本实验采用体外神经元缺氧缺糖(OGD)模型模拟体内脑缺血/再灌损伤建立缺氧诱导凋亡模型,对PNN的神经保护作用进行评价,并探索PNN与HIF-1α有关的细胞凋亡调节分子机制。结果表明PNN在1-10μmol/L时具有保护作用,5μmol/L PNN保护作用最强。其作用机制与在缺氧后恢复培养早期上调HIF-1α表达,恢复培养后期通过升高Bcl-2/Bax比例、抑制caspase-3激活阻断凋亡级联反应有关。在本部分实验中,三七脂溶性部位的天然小分子化合物PNN的抗缺氧活性被确认,证实我们合成具有神经保护作用的AEA类似物-EMA家族化合物的可行性,为以下对NsTyr的研究提供实验基础及理论依据。　　 第二部分内源性大麻素AEA类似物的神经保护作用研究　　 大麻素系统介导的神经保护作用是哺乳动物自身保护系统的重要环节之一,内源性大麻素N-花生四烯酰乙醇胺(anandamide,AEA)被广泛报道对多种急性神经损伤(脑缺血/再灌损伤等)及多种神经退行性疾病(阿尔茨海默症、多发性硬化症等)具有保护作用。然而由于AEA的作用多靶点性使其在神经系统中依剂量范围不同对不同病理模型具有神经保护或神经损伤双重作用,因此寻找可将保护作用及神经毒性作用分离的AEA的类似物引起越来越多研究者的关注。其中“elmiric acid”(EMA)家族化合物是研究报道较多的AEA类似物,其化学结构由饱和或不饱和脂肪酸与不同氨基酸基团结合成化合物单体。本部分工作涉及对前期工作筛选出的EMA中的成员NsTyr进行体外神经元缺氧缺糖损伤及Aβ损伤的神经保护作用及机制研究。　　 (一)NsTyr对体外OGD损伤的神经保护作用　　 本课题第一部分的实验验证了PNN的抗低氧活性,本部分研究采用前部分实验建立的OGD模型研究NsTyr对缺氧引起的神经元损伤的作用及其分子机制。急性脑缺血可引发脑部缺血缺氧,导致神经元坏死和凋亡两种不同的细胞死亡过程。本研究中OGD损伤1h再恢复培养24h,细胞活力下降45％,镜下进行形态学观察,神经元呈现坏死及凋亡两种状态,给予NsTyr后可以减轻由于缺氧缺糖引起的神经元损伤状态。　　 缺氧时神经元能表达诱导型一氧化氮(iNOS)和ROS过量产生,二者不仅可以通过不同途径分别诱导细胞凋亡,还相互影响形成恶性循环。本研究结果表明,NsTyr的作用机制是通过抑制ROS产生及iNOS表达,打破二者相互作用的恶性循环,从而维持Bcl-2/Bax平衡,抑制细胞级联凋亡,其抗凋亡途径由ERK、p-38信号通路介导。　　 (二)NsTyr神经保护作用的靶点　　 EMA家族化合物为目前研究报道较多一类AEA类似物,NsTyr属于EMA家族中的成员。在第二部分实验中我们发现NsTyr具有明显的抗缺氧作用,本研究内容旨在探讨NsTyr与大麻素受体CB1是否具有亲和力及NsTyr对神经元OGD损伤保护作用是否由大麻素系统介导。我们的研究结果显示,NsTyr与CB1无亲和力,提示NsTyr的神经保护作用并不是直接由大麻素受体CB1介导,但NsTyr可以下调OGD引起的内源性大麻素水解酶FAAH过度表达,通过降低FAAH抑制AEA水解,维持内源性AEA水平,间接参与大麻素系统介导的神经保护作用。　　 (三)NsTyr通过调控MAPK通路抑制Aβ诱导的原代皮层神经元凋亡　　 在确认NsTyr的抗低氧活性后,我们探索NsTyr的其它神经保护活性。Aβ在体外具有神经毒性,其生成和聚积可以激活凋亡细胞死亡级联反应并导致细胞死亡,本研究采用Aβ25-35活化后的毒性片断对原代皮层神经元损伤48小时,通过MTT及LDH检测细胞活性,Hoechst33342染色形态学观察及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪定量检测细胞凋亡,并评价NsTyr的干预作用；通过Westernblot检测MAPK中信号分子及凋亡蛋白家庭中成员的蛋白表达水平,分析NsTyr干预后MAPK信号通路在凋亡中的影响,探讨NsTyr抗凋亡作用的MAPK信号通路机制。本研究发现NsTyr可对抗Aβ25-35诱导的神经元损伤,并呈量效关系；NsTyr可抑制Aβ25-35诱导的神经元早期凋亡；Aβ25-35处理后可诱导神经元p-ERK表达下调和p-p38及p-JNK上调,NsTyr可逆转p-ERK和p-p38表达,但对p-JNK表达没有影响；研究通过LDH实验确定了MAPK通路中ERK及p38磷酸化后各自在Aβ损伤中的作用,并发现NsTyr通过激活p-ERK-Bcl-2通路,抑制p-p38-Bax通路发挥神经保护作用。研究还注意到:p-ERK和p-p38 MPAK信号通路间存在动态平衡,这类似于传统中医理论中的“阴阳失衡”,此发现对信号转导的系统研究提供新思路。　　 含有饱和或不饱和长链结构的脂溶性小分子化合物可穿过血脑屏障进入中枢发挥活性作用,我们在深入文献资料研究和此类化合物构效关系研究的基础上,又发现三七脂溶性部位的天然长链小分子化合物PNN具有抗缺氧的神经保护活性,这为我们设计具有长链结构并同时具有神经保护活性的脂溶性小分子化合物提供了理论依据和实验基础,也证实合成并研究具有神经保护作用的AEA类似物--EMA家族化合物的可行性。　　 NsTyr为我们合成的AEA类似物,属于EMA家族成员。体外神经元OGD损伤模型表明NsTyr预处理可以减轻神经元损伤,具有神经保护作用,其作用机制是通过抑制ROS产生及iNOS表达,打破二者相互作用的恶性循环,维持Bcl-2/Bax平衡,抑制细胞级联凋亡。体外Aβ损伤模型也表明NsTyr具有神经保护活性,其抗Aβ损伤机制是通过激活p-ERK-Bcl-2通路,抑制p-p38-Bax通路减少神经元凋亡。通过本研究探讨NsTyr的作用靶点,表明NsTyr不能通过激活CB1受体发挥作用,但其可以抑制FAAH过度表达,维持内源性AEA水平,间接参与大麻素系统的神经保护作用。我们首次证明了NsTyr作为EMA家族成员具有神经保护作用,具备进一步的开发研究价值,并为这类化合物的研究开发提供了先导化合物和实验基础。同时,本文发现NsTyr不能激活CB1受体,而抑制FAAH只是维持内源性AEA的生理水平,这样可以减少CB1受体广泛激活引起的精神系统失衡,为进一步寻找作用靶点相对单一的AEA类似物提供实验依据和创新思路。NsTyr的具体作用靶点及其是否通过CB2途径,还是其它no-CB1/non-CB2途径发挥作用需要更深入研究及探索。　　 本研究对天然及合成的含长链脂肪链的脂溶性小分子化合物进行神经保护作用研究,人参炔醇及硬脂酰酪氨酸具有较强的脂溶性,可穿过血脑屏障,为较理想的神经保护药物的先导化合物,并可能进一步转化为治疗老年退行性病变药物的候选化合物。本研究对AEA类似物的作用机制的深入研究,对于发现药物作用的新靶点奠定了基础,因此既具有学术价值又具有社会意义。