恶性肿瘤是由于环境和遗传因素共同作用而导致的严重影响人类健康的疾病。在我国,胃癌是主要高发的恶性肿瘤之一。胃癌的转移性复发是导致患者死亡的主要原因,而对于胃癌的临床治疗至今仍缺乏理想的化疗或辅助化疗方案,效果欠佳。研究胃癌发生发展的规律,阐明胃癌转移相关的分子机制,是研发新的胃癌靶标药物的重要基础。在肿瘤转移的诸多环节中,新生血管形成是一个重要步骤。肿瘤的血管生成是一复杂过程,很多分子参与其中。血管生成的基本步骤为：(1)肿瘤血管生成因子与血管生成抑制因子失衡,血管生成表型(angiogenic phenotype)形成。(2)血管内皮基底膜的降解。(3)内皮细胞向肿瘤组织迁移及在迁移中增殖。(4)内皮细胞管道化、分支化形成血管环。(5)形成新的基底膜。肿瘤血管生成因子包括IL-8、IL-6、VEGF等。这些分子的表达受NF-κB的调节。NF-κB在胃癌血管生成过程中发挥关键性作用。NF-κB的亚单位p65是决定NF-κB活性的核心分子,在正常细胞中NF-κB的活化和失活保持动态平衡。而肿瘤细胞中,NF-κB常表现为过度活化,导致平衡失调,肿瘤细胞因此获得侵袭、转移、抗凋亡及促进肿瘤血管生成等特性。肿瘤细胞中NF-KB/p65活性调节的平衡机制是肿瘤领域的研究热点和难点。众多研究表明,p65受到外源性刺激进入细胞核,激活下游很多分子的表达,但是目前p65蛋白的自身调节机制还不清楚。近来有研究发现p65蛋白通过泛素-蛋白酶体途径的调控维持其在细胞内的稳定性,如DLIM2, COMMD1, pin1等泛素连接酶均可调节p65的表达,这些分子也是肿瘤治疗研究的潜在靶标。我们相信细胞内还存在调节p65的表达的其它泛素连接酶,类似功能分子的挖掘和调节机制研究必将为阐明抗肿瘤血管生成研究提供新的思路。本课题组前期研究发现JWA通过转录和蛋白翻译后修饰途径调节DNA修复蛋白XRCC1的表达,从而参与氧化应激诱导的DNA碱基切除修复(BER)过程。随后研究发现JWA和XRCC1在胃癌发生、发展及预后过程中发挥重要作用。有研究发现热休克70(Hsp70)羧基端相互作用蛋白(CHIP)作为一种泛素连接酶可以调节XRCC1蛋白的稳定,从而参与BER过程。此外,CHIP能降解很多癌基因编码蛋白(如雌激素受体α、SRC-3、ErbB2等)的表达,从而抑制乳腺癌细胞的锚定生长和侵袭转移,干涉CHIP的表达可增加乳腺癌组织中的血管生成,但潜在的分子机制还不清楚。本研究旨在探讨CHIP在胃癌发生发展中是否发挥作用?此过程中是否涉及NF-κB/p65信号通路?以及CHIP是否能作为判断胃癌预后的分子标志物?围绕这些科学问题,我们采用一系列细胞和小鼠模型,结合对两个独立胃癌组织芯片及其生存数据库的统计分析,从临床、动物、细胞、分子等多个角度系统探讨了CHIP在胃癌血管生成中的作用及其分子机制。结果：1. CHIP在胃癌中表达水平显著降低。采用q-PCR和Western blot技术分别对16例胃癌手术病例的癌组织和癌旁组织中CHIP的mRNA和蛋白水平进行检测,发现其中12例患者癌组织中CHIP的mRNA表达水平低于癌旁组织,14例患者癌组织中CHIP的蛋白水平低于癌旁组织,癌细胞中CHIP主要定位于胞浆；而在正常细胞中,CHIP在胞浆和胞核中均有分布。74例胃癌患者术后肿瘤标本制作的组织芯片中检测发现,有64例患者的癌组织CHIP表达低于癌旁组织。2. CHIP表达水平降低与胃癌患者临床病理特征与不良预后具有显著相关性。通过对两个胃癌手术患者研究队列CHIP表达与患者临床病理特征及预后分析,发现CHIP在癌组织中的表达与肿瘤的临床特征,如浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期和病理指标具有显著相关性(P<0.05)。Kaplan-Meier曲线分析结果显示,CHIP低表达胃癌患者预后较差(P<0.001,log rank test)。多因素COX回归模型分析显示,CHIP表达水平是独立的预后评价指标(HR=0.34,95%CI=0.15-0.76,实验组；HR=0.21,95%CI=0.16-0.26,验证组)。时间依赖性ROC分析显示联合临床指标(TNM分期,组织类型,肿瘤大小)和CHIP表达这两种指标评价预后较单一指标效果要好。用单一的临床指标进行预后评判时,发现在实验组与验证组的5年AUC分别是0.688(95%CI=0.550-0.826)和0.723(95%CI=0.675-0.770),当联合病例指标和CHIP表达后,AUC分别上升至0.760(95%CI=0.621-0.899)和0.842(95%CI=0.806-0.878)。3. CHIP抑制胃癌细胞的生长和血管生成。体外实验研究发现胃癌细胞中CHIP高表达可以抑制其在软琼脂中的集落形成能力,CHIP高表达胃癌细胞培养液上清抑制人脐静脉血管细胞(HUVEC)的管状生成能力。反之,抑制胃癌细胞CHIP的表达可以增强其在软琼脂中的集落形成能力,CHIP低表达胃癌细胞培养液上清抑制了HUVEC的管状生成能力。裸鼠荷瘤实验证明CHIP高表达细胞株肿瘤生长明显减慢,用CD31标记的肿瘤中微血管的密度也显著降低。4. CHIP抑制胃癌细胞的粘附和侵袭。细胞粘附实验证实CHIP高表达使得胃癌细胞在纤连蛋白包被平板和玻连蛋白包被平板上的粘附率分别降低41%和32%；而CHIP低表达使得胃癌细胞在纤连蛋白包被平板和玻连蛋白包被平板上的粘附率分别上升88%和79%。细胞侵袭实验证实CHIP的高表达使得胃癌细胞BGC823和MGC803穿过基底膜的能力分别下降51%和48%；而CHIP的低表达使得胃癌细胞BGC823和MGC803穿过基底膜的能力分别提高175%和90%。5. CHIP通过抑制NF-κB-IL-8信号通路阻断胃癌血管生成。在肿瘤血管生成过程中,NF-κB信号通路起着关键性的作用,而NF-κB的活性显著地受到泛素蛋白酶体途径调控。我们研究发现CHIP的高表达抑制了胃癌细胞中NF-κB的活性以及下游促血管生成分子IL-8的表达,CHIP的低表达激活了胃癌细胞中NF-κB的活性以及下游促血管生成分子IL-8的表达。而IL-8的回复和阻断模型则证明了CHIP是通过NF-κB-IL-8通路发挥抑制胃癌血管生成的作用。6. CHIP通过泛素蛋白酶体途径降解NF-κB亚单位p65。我们进一步采用多种分子生物学技术研究发现,CHIP的高表达抑制了p65向细胞核转位及NF-κB与DNA的结合能力,p65蛋白本底及其磷酸化水平。用蛋白合成抑制剂CHX处理细胞,CHIP高表达组的p65降解显著加快,而CHIP低表达组的p65降解显著延迟。采用免疫共沉淀实验证明CHIP与p65之间存在相互作用,而将细胞浆核分离之后则发现CHIP与p65之间的相互作用只发生在细胞核内,而非细胞浆。当使用蛋白酶体抑制剂MG132预处理CHIP高表达细胞后,p65降解受到抑制,p65的泛素化水平明显增高。这些结果证明泛素连接酶CHIP能够介导p65通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。结论：本研究采用细胞模型、动物实验结合人群组织样本和临床资料,利用细胞和分子生物学技术从多个角度证实CHIP表达在胃癌发生、发展过程中发挥重要作用,而且它可以作为胃癌病人预后判断的生物标志物。在机制研究中,我们发现CHIP通过抑制NF-κB-IL-8途径阻断胃癌血管生成,从而影响胃癌细胞的转移。这些发现可能为研发以CHIP为靶点的治疗策略和手段提供了理论依据,也为通过阻断胃癌的血管生成治疗胃癌转移提出了新的思路。