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血管钙化(vascular calcification)是动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病、高血压和糖尿病等的常见血管病变及主要并发症之一。当血管钙化出现时,预示着更坏的临床结果和心血管不良事件,但导致血管钙化的机制尚不清楚。血管钙化与慢性肾脏疾病中矿物质代谢的紊乱有关。其中血清磷已成为慢性肾脏疾病患者血管钙化的重要调节因子。在慢性肾衰(chronic renal failure,CRF)的小鼠模型中,高磷饮食可诱导主动脉中层的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的钙化。体外实验也表明,高磷血症个体中相同水平的高磷酸盐可直接促进VSMC的钙化,导致VSMC从收缩表型转变为骨软骨表型。肾素-血管紧张素系统(RAS)是调节体液、电解质平衡和血压的内分泌系统。慢性肾脏疾病与RAS的持续激活有关,其中血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)还与慢性肾脏疾病相关的动脉钙化过程有关。AngⅡ结合的受体有2种亚型,1型(AT1)和2型(AT2)受体。大多数Angll的作用是由AT1受体介导的,而AT2受体介导了与AT1受体相反的有益作用。AT2受体与AT1受体同源性低,但是AngⅡ对两种受体亚型都表现出相似的亲和力。AT2受体在胎儿器官中大量表达,但在成年生物体的大多数组织中表达量很低。然而,在诸如充血性心力衰竭、肾衰竭等病理条件下,或在诸如皮肤损伤、血管损伤、心肌梗塞、脑缺血或周围神经切断等事件中,AT2受体被重新表达。多年来,很难揭示AT2受体的生理或潜在的病理生理功能。因为在正常生理条件下,这种受体在包括心血管相关组织在内的许多组织中几乎不能检测到。尽管很难评估其在健康组织或胎儿发育过程中的生理作用,近年来已经描述了 AT2受体介导的有益作用在心血管和肾脏疾病中变得明显。然而,目前还没有关于AT2受体在血管钙化形成中作用的相关报道。血管紧张素-(1-7)(Ang-(1-7))是RAS系统中的一种新的生物活性成分,通过与特异性Mas受体结合而发挥作用。Ang-(1-7)已被发现与Ang Ⅱ在心脏、血管、肺、肾、脑和肝脏中的多种作用相抗衡。Ang-(1-7)对血压的影响主要通过其在血管、肾脏和大脑中的直接作用发生。在成年Ⅰ型自发性糖尿病小鼠中,连续6周给予Ang-(1-7)能够防止收缩压升高,而同时给予Mas受体的抑制剂A-779可以消除收缩压升高。Ang-(1-7)还可以改善与高血压相关的心脏参数,如减少心肌细胞肥大、总胶原沉积、Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白基因的表达。有研究证明,Ang-(1-7)减少了高血压动物心肌细胞的直径。越来越多的证据表明Ang-(1-7)具有心血管的保护作用。有文章研究了 Ang-(1-7)可抑制维生素D3加尼古丁诱导的大鼠钙化模型中的血管钙化。然而,Ang-(1-7)对血管钙化的影响仍然不是非常清楚,需要进一步探讨。因此,本实验研究AT2受体及Ang-(1-7)在动脉钙化中的作用及其机制。体内实验以小鼠5/6肾切除慢性肾脏疾病模型制备体内钙化模型,体外实验以培养小鼠主动脉平滑肌细胞并用钙化培养基诱导其钙化为体外钙化模型,用AT2受体敲除和增加其表达的方式和/或给予Ang-(1-7),来研究它们对血管钙化过程的影响,试图寻找血管钙化治疗的潜在的靶点。方法体内实验中,分别用ApoE和ApoE/AT2K0小鼠制备5/6肾切除慢性肾脏疾病模型。在麻醉下,进行两次手术。第一次,分别切除左侧肾脏上下极的1/3肾脏组织。两周后进行第二次手术,结扎切除全部右肾。部分小鼠术后使用渗透泵腹腔内以0.5mg/kg/天的剂量给Ang-(1-7)6周。分别在术前和术后2周取血清样品,进行生化分析,测定血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、无机磷酸盐(IP)和钙(Ca)的含量。术后6周的小鼠主动脉样本,通过实时定量PCR的方法,检测主动脉中骨细胞表型相关蛋白骨形态发生蛋白2(BMP-2)、骨保护素(OPG)、骨钙素(OCN)、成骨转录因子(RUNX2)、AT1受体和Mas受体表达的变化。体外实验中,分别从WT和SmAT2的小鼠中取原代培养胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)进行培养。将细胞培养在含5%FBS、0.25mM抗坏血酸和1OmMβ-甘油磷酸盐的钙化培养基中14天。部分以100nM的浓度加入Ang-(1-7)培养14天。通过茜素红S染色鉴定钙在VSMC中的沉积。将茜素红洗脱液用分光光度计测定吸光度,对茜素红染色进行定量分析。钙化培养基培养14天的VSMC样本,通过实时定量PCR的方法,检测主动脉中骨细胞表型相关蛋白BMP-2、OPG、OCN、RUNX2、骨桥蛋白(OPN)、AT1受体和Mas受体表达的变化。结果1.ApoE/AT2K0小鼠与ApoE小鼠相比,慢性肾脏疾病模型术后2周血清BUN和IP升高,且BMP-2和RUNX2表达的改变有统计学差异,提示了 AT2受体敲除小鼠慢性肾脏疾病所引起的主动脉钙化更加严重。2.细胞实验中,SmAT2+IP组与WT+IP组相比,茜素红S染料洗脱液的吸光度降低,且BMP-2、OPG、OCN、RUNX2和OPN表达的改变具有统计学意义,证明了 AT2受体的高表达可阻止VSMC钙化的形成。3.ApoE小鼠慢性肾脏疾病模型+Ang-(1-7)组与模型组相比,血清BUN、Cre和IP降低,且BMP-2和RUNX2的表达减少,提示了 Ang-(1-7)可以改善小鼠慢性肾脏疾病所导致的主动脉钙化的形成。4.细胞实验中,IP+Ang-(1-7)组与IP组相比,茜素红S染料洗脱液的吸光度降低,且BMP-2、OCN、RUNX2和OPN表达的改变具有统计学意义,证明了 Ang-(1-7)可阻止VSMC钙化的形成。5.ApoE/AT2K0小鼠慢性肾脏疾病模型+Ang-(1-7)组与模型组相比,BMP-2、OPG、OCN和RUNX2表达均未发生变化,说明了在AT2受体敲除小鼠中Ang-(1-7)不能改善慢性肾衰所导致的主动脉钙化的形成,所以Ang-(1-7)改善慢性肾脏疾病所导致的主动脉钙化的作用与AT2受体的表达紧密相关。结论本实验证明了 AT2受体的表达和Ang-(1-7)的给予均可通过调节骨细胞表型的相关蛋白的表达,来阻止血管钙化的形成。并且Ang-(1-7)对血管钙化的保护作用跟AT2受体的表达密切相关。