实验目的：　　 膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤。膀胱肿瘤的发生和复发主要与机体免疫功能低下、肿瘤细胞逃逸机体的免疫监视有关，如何提高膀胱肿瘤患者的免疫功能成为治疗和预防膀胱肿瘤复发的关键，因而肿瘤的免疫治疗方法越来越受关注。肿瘤特异性免疫治疗的基础是肿瘤细胞具有抗原性并能引起机体的免疫应答。抗肿瘤免疫主要是T细胞介导的细胞免疫，有效的抗原提呈，是机体抗肿瘤免疫的始动因素。肿瘤细胞由于MHC-Ⅰ类分子表达低下及共刺激分子的缺乏，导致自身提呈抗原能力低下，肿瘤特异性T细胞的激活必需依赖于抗原提呈细胞的帮助。树突状细胞(Dendritic cell DC)是体内唯一能够激活初始T细胞的抗原提呈细胞，是启动、调控并维持免疫应答的重要环节。有研究表明，恶性肿瘤细胞在患者体内释放的免疫抑制因子能抑制DC的生物学活性，使其不能有效提呈肿瘤抗原激发机体的抗肿瘤免疫，导致肿瘤细胞的逃逸。更有实验证实在膀胱肿瘤组织中浸润的DC成熟受抑，共刺激分子CD80、CD86的表达下调，可能是其发生免疫逃逸的机制之一。因此研究以DC为基础的DC疫苗免疫治疗方法将成为膀胱肿瘤治疗和预防复发的有效手段。　　 制备DC疫苗的基本方法是将肿瘤抗原负载DC。而DC疫苗有效性的首要前提是DC具有正常的生物学功能。促进DC的成熟、增强其功能则是提高DC疫苗免疫效果的重要手段。将细胞因子基因导入DC或通过细菌DNA序列CpG刺激、HSP冲激DC等方法均能促进DC的成熟，从而促进其抗原提呈功能，提高DC疫苗免疫效果。Morales将BCG经膀胱灌注用于膀胱癌的治疗取得了成功。Tokunaga等发现从BCG中提取的DNA片段具有抗肿瘤活性。研究还发现从BCG中提取的Ag85复合物具有较强的免疫刺激活性。其中Ag85ADNA疫苗可刺激机体Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α等的产生水平升高；促进细胞毒性T细胞(CTL)的细胞毒活性，增强NK细胞、单核-巨噬细胞的肿瘤杀伤活性。Ag85A基因转染的DC疫苗已用于抗结核的实验研究，但以此转染的DC疫苗用于膀胱癌的研究国内外尚无报道。本研究构建了Ag85A真核表达载体，将其转染小鼠树突状细胞株DC2.4，观察Ag85A基因转染的DC免疫生物学特性的变化，并以Ag85A基因修饰的DC2.4负载膀胱肿瘤抗原制备DC疫苗，观察其在体内外对膀胱肿瘤的免疫学效应。　　 实验方法：　　 1、重组质粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A的构建及转化经PCR扩增的目的基因Ag85A与载体pcDNA3.1/myc-hisA连接后转化到大肠杆菌E.coli DH5α，提取质粒经酶切电泳鉴定和测序证实。　　 2、重组质rpcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A转染DC2.4采用lipofectamine2000进行pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重组质粒转染DC2.4，同时设pcDNA3.1/myc-hisA空质粒转染和未转染DC2.4作为对照。48h后收获瞬时转染细胞。瞬时转染48小时后按筛选试验中所确定的最佳G418浓度(500μg/ml)加入G418进行稳定转染细胞的筛选，持续筛选3周后获稳定转染细胞株，即DC-Ag85A、DC-pcDNA。　　 3、RT-PCR法检测瞬时及稳定转染DC中Ag85A mRNA表达瞬时及稳定转染DC样品抽提总RNA进行RT-PCR检测Ag85A基因的mRNA表达。　　 4、MTT法检测转染DC刺激T细胞增殖能力转染pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重组质粒、pcDNA3.1/myc-hisA空质粒和未转染的DC2.4细胞，加入丝裂霉素C灭活，调整细胞浓度为4×105/ml，作为刺激细胞。制备C57BL/6小鼠脾细胞悬液，红细胞裂解液溶解红细胞，尼龙毛柱分离T淋巴细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，作为反应细胞。在96孔细胞培养板中，每孔加入反应细胞和刺激细胞各100μl，分别于37℃、5％CO2培养箱中培养24h、48h、72h和96h，MTT法检测。　　 5、流式细胞术检测转染DC膜表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达水平上述转染的各组DC，调整细胞浓度至1×107/ml。取100μl细胞悬液加入到FACS测定管中，各管分别加入抗-CD80-PE单克隆抗体、抗-CD86-PE单克隆抗体、抗-MHCⅡ-PE单克隆抗体冰浴30 min，流式细胞仪检测。　　 6、MB49粗提抗原及负载肿瘤抗原DC疫苗的制备收集对数生长期的MB49细胞，反复冻融离心，取上清，制备粗提抗原。将稳定转染的DC-Ag85A、DC-pcDNA和DC2.4接种于6孔细胞培养板，然后加入MB49粗提抗原，37℃、5%CO2培养48h负载抗原。制成DC-Ag85A疫苗、DC-pcDNA疫苗和DC2.4疫苗。　　 7、MTT法检测DC疫苗刺激的效应T细胞对MB49细胞的细胞毒效应上述DC疫苗及未负载肿瘤抗原的DC2.4细胞，加入丝裂霉素C，37℃30min灭活。灭活的DC按照1:10的比例与分离的C57BL/6小鼠脾T淋巴细胞共培养，并以未经DC刺激的T淋巴细胞作为对照。培养72h收集悬浮细胞即为DC疫苗刺激的效应T细胞。以对数生长期的MB49细胞作为靶细胞，浓度为4×105/ml。按效：靶等于10:1加入96孔板，同时以单纯效应细胞和单纯靶细胞作对照，培养72h，MTT法检测。　　 8、ELISA检测负载肿瘤抗原DC疫苗刺激的效应T细胞分泌IFN-γ水平采用ELISA法对上述各组DC疫苗刺激的效应细胞上清IFN-γ的含量进行检测，酶标仪检测450nm处OD值，应用SoftMax Pr04.3.1 LS软件分析，绘制标准品曲线，计算样品中IFN-γ的含量。　　 9、MB49皮下移植瘤动物模型的建立和分组及其免疫MB49细胞1×107/ml，第0天注射1×106细胞于待实验的C57BL/6小鼠背部皮下。24只小鼠共分为4组，即DC-Ag85A疫苗组、DC-pcDNA疫苗组、DC2.4疫苗组和PBS对照组，每组6只，雌雄各半，分别在接种肿瘤细胞后的第1、7和14天于每只小鼠的接种肿瘤部位局部注射DC-Ag85A疫苗、DC-pcDNA疫苗、DC2.4疫苗和PBS0.1ml，DC细胞数为1×106。　　 10、肿瘤生长情况的检测接种后每天观察肿块的形成情况，记录潜伏期。第21天处死小鼠剥离肿瘤，测量肿块的长径a和短径b，计算肿瘤体积。同时称取肿瘤重量。分别计算重量和体积抑瘤率。　　 11、肿瘤组织切片病理学检查剥离小鼠皮下肿瘤组织做常规组织切片，H-E染色，光镜观察组织病理学改变。　　 12、免疫组化分析肿瘤组织中浸润T细胞亚群上述组织切片用抗-CD4和抗-CD8单克隆抗体进行免疫组化染色，分析肿瘤组织中浸润T细胞亚群。　　 13、流式细胞仪检测荷瘤小鼠脾T细胞亚群取各组小鼠脾脏制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为1×107/ml。每份样品用抗-CD4-FITC单克隆抗体和抗-CD69-PE单克隆抗体进行双色染色分析，另设阴性对照管。流式细胞仪检测。　　 14、ELISA检测荷瘤小鼠脾细胞培养上清IFN-γ水平采用ELISA法对上述各组小鼠脾细胞培养上清IFN-γ的含量进行检测，酶标仪检测450nm处OD值，应用SoftMax Pro4.3.1 LS软件分析，绘制标准品曲线，计算样品中IFN-γ的含量。　　 实验结果：　　 1、重组质粒构建及转化从转化后的E.coli DH5α中提取pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重组质粒，酶切电泳鉴定质粒中存在Ag85A基因片段，经测序与GenBank中序列完全一致。　　 2、RT-PCR法检测瞬时及稳定转染DC中Ag85A mRNA表达结果显示瞬时及稳定转染pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重组质粒的DC2.4，均有Ag85A的mRNA表达。　　 3、转染DC刺激小鼠T淋巴细胞增殖DC-Ag85A刺激T细胞增殖的能力随培养时间的增加而增强，72h达高峰，96h开始下降。DC-Ag85A在48h和72h时的刺激指数(SI值)分别为10.61±1.06和16.80±2.23，均显著高于DC-pcDNA(5.90±0.80和7.56±0.57)和DC2.4(7.40±0.88和10.75±0.68)对照组，差异显著。　　 4、转染DC膜表面分子的变化结果显示，DC-Ag85A膜表面CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的表达率分别为54.05±2.46%、65.29±2.03%和47.83±1.78%，均高于DC-pcDNA(27.87±1.51%、49.43±1.23%和14.49±0.91%)和DC2.4对照组(27.01±0.69%，39.43±3.42%和15.39±1.28%)，差异显著。　　 5、DC疫苗刺激的脾T细胞对MB49细胞的细胞毒效应DC-Ag85A疫苗刺激的脾T细胞对MB49的细胞毒效应(73.88±4.64%)高于DC-pcDNA疫苗和DC2.4疫苗组(51.25±6.75%和54.50±5.31%)，也高于未负载肿瘤抗原的DC2.4(47.03±3.83%)及单纯T细胞对照组(41.73±7.44%)，差异显著。　　 6、DC疫苗刺激的脾T细胞乡泌IFN-γ的水平结果显示，DC-Ag85A疫苗刺激的脾T细胞分泌IFN-γ水平(270.05±33.56pg/ml)显著高于DC-pcDNA疫苗(93.69±6.30pg/ml)和DC2.4疫苗组(102.14±16.95pg/ml)，也显著高于未负载肿瘤抗原的DC2.4(5.72±0.99 pg/ml)及单纯脾T细胞对照组(6.31±1.64 pg/ml)，差异显著。　　 7、荷瘤鼠肿瘤生长情况与PBS对照组相比，DC-Ag85A疫苗组肿瘤形成潜伏期延长(13.33±2.875d)，肿瘤体积(2.32±0.92cm3)和肿瘤重量(2.16±0.91g)明显降低。DC-Ag85A疫苗组、DC-pcDNA疫苗组和DC2.4疫苗组对肿瘤体积和肿瘤重量的抑瘤率分别为51.76%和54.43%、23.28%和28.48%、25.36%和26.79%。　　 8、肿瘤组织病理学观察DC-Ag85A疫苗组有大量炎性细胞浸润，其它疫苗组和PBS组均仅见少量炎性细胞浸润。　　 9、肿瘤组织中浸润T细胞亚群结果显示，DC-Ag85A疫苗组浸润CD4+和CD8+T细胞亚群(23.96±4.18个/HP和28.07±4.74个/HP)显著高于PBS对照组(3.39±1.23个/HP和6.22±3.36个/HP)；也高于DC-pcDNA疫苗组(17.66±2.23个/HP和14.27±3.11个/HP)和DC2.4疫苗组(15.45±2.34个/HP和12.56±3.15个/HP)。　　 10、荷瘤鼠脾T细胞亚群的变化DC-Ag85A疫苗组小鼠脾脏CD4+T和CD4+CD69+T细胞数量分别为22.77±3.95%和8.24±1.42%显著高于PBS对照组(17.42±4.27%和3.97±0.79%)。DC-Ag85A疫苗组CD4+CD69+T细胞数量(8.24±1.42%)显著高于DC-pcDNA疫苗(3.71±0.95%)、DC2.4疫苗组(3.98±0.91%)和PBS对照组(3.97±0.79%)。　　 11、荷瘤鼠脾细胞培养上清IFN-γ水平DC-Ag85A疫苗组脾细胞培养上清中IFN-γ水平(430.59±53.41 pg/ml)显著高于DC-pcDNA(110.89±16.58 pg/ml)、DC2.4疫苗组(119.95±30.84 pg/ml)和PBS对照组(5.49±0.63 pg/ml)。　　 结论：　　 1、重组质粒pc-DNA3.1/myc-his-Ag85A成功转染DC2.4，建立了有Ag85AmRNA稳定表达的DC细胞株。　　 2、Ag85A基因转染可增强DC2.4膜表面分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表达，促进DC2.4的成熟及其对刺激T淋巴细胞增殖的能力。提示转染Ag85A基因可能会提高DC的抗原提呈能力。　　 3、负载膀胱肿瘤抗原的Ag85A基因修饰的DC疫苗，可体外刺激效应T细胞对膀胱肿瘤细胞系的细胞毒作用增强和IFN-γ的分泌水平升高，提示该疫苗具有增强抗膀胱肿瘤效应。　　 4、Ag85A基因修饰的DC疫苗对膀胱癌荷瘤小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用。可能通过促进肿瘤局部T淋巴细胞浸润，增强局部免疫应答。同时通过上调脾CD4+CD69+T细胞，促进了脾T细胞的活化和IFN-γ的分泌，增强了抗肿瘤的细胞免疫应答。