【摘 要】
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第一部分:囊型肝包虫中钙化性纳米微粒的分离、培养及特征观察目的:从囊型肝包虫外囊组织中分离和培养钙化性纳米微粒并实施形态学鉴别,以证实胆漏的肝包虫钙化囊壁中存在钙化性纳米微粒,为下文的研究提供基础。方法:收集37例囊型肝包虫病例,拟从包虫的外囊壁组织中分离培养出钙化性纳米微粒,观察肝包虫胆漏与包虫外囊壁钙化的关系;电镜观察于囊壁培养出的钙化性纳米微粒的特征;检测肝包虫外囊壁中钙化相关蛋白（OPN和
【基金项目】
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中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（2020-PT330-003）；
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第一部分:囊型肝包虫中钙化性纳米微粒的分离、培养及特征观察目的:从囊型肝包虫外囊组织中分离和培养钙化性纳米微粒并实施形态学鉴别,以证实胆漏的肝包虫钙化囊壁中存在钙化性纳米微粒,为下文的研究提供基础。方法:收集37例囊型肝包虫病例,拟从包虫的外囊壁组织中分离培养出钙化性纳米微粒,观察肝包虫胆漏与包虫外囊壁钙化的关系;电镜观察于囊壁培养出的钙化性纳米微粒的特征;检测肝包虫外囊壁中钙化相关蛋白（OPN和BMP-2）表达情况;分析胆漏、钙化性纳米微粒与囊壁钙化的相关性。结果:（1）定量统计数据和CT影像分析均证实囊性肝包虫囊壁钙化与胆漏发生存在显著相关性。（2）免疫组化及Western-blot检测显示胆漏的肝包虫囊壁中钙化蛋白OPN及BMP-2的表达高于未胆漏的肝包虫囊壁中的表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（3）通过对包虫钙化的囊壁,囊内容物、囊液和胆汁进行分离、培养,4周后于试管底部均可见白色沉淀物,Western-blot检测胎球蛋白A表达阳性,且以胆汁中表达最高,电镜分析符合钙化性纳米微粒的特征。（4）定量统计数据表明囊型肝包虫外囊中有无钙化性纳米微粒与其胆漏发生,以及外囊壁中有无钙化性纳米微粒与包虫胆漏、外囊壁钙化的发生均存在显著相关性。结论:（1）验证了包虫胆漏是造成囊型肝包虫外囊壁钙化的重要因素。（2）首次在囊型肝包虫钙化外囊壁中分离培养并证实钙化性纳米微粒的存在。（3）证明胆漏、钙化性纳米微粒与肝包虫囊壁钙化之间存在一定相关性,为研究囊型肝包虫病的自然病程和治疗囊型肝包虫病提供重要的思路。第二部分:钙化性纳米微粒作用于间充质干细胞钙化机制的初步研究目的:初步探究钙化性纳米微粒作用于间充质干细胞（MSC）导致其钙化的机制研究,以间接证实肝包虫囊壁钙化与钙化性纳米微粒之间的关联性,为今后实施临床研究提供基础。方法:选取原代培养的小鼠MSC细胞为研究对象,对各组细胞如下处理:添加等量生理盐水的Control组、添加低浓度的纳米级羟基磷灰石（NHAC组）、添加低浓度的钙化性纳米微粒（L-CNPs组）和添加高浓度钙化性纳米微粒（H-CNPs组）。对培养3天和6天的各组细胞进行定性定量检测,包括光镜观察形态学变化;CCK-8检测各组细胞增殖情况;免疫荧光分析OPN、BMP-2及TGF-β1/Smad3蛋白表达;流式细胞仪检测细胞6天后凋亡和钙离子浓度;碱性磷酸酶染色和茜素红染色分析胞内钙沉积现象;Western-blot检测各组细胞中OPN、BMP-2和RUNX2,Bax和Caspase-3以及TGF-β1和Smad3蛋白浓度的表达等。结果:（1）光镜观察随着钙化性纳米微粒培养浓度的增加,MSC细胞溶解死亡明显增多。（2）CCK-8检测钙化性纳米微粒可以明显抑制MSC细胞的增殖趋势,随着微粒浓度以及培养时间的增加,抑制作用增强。（3）流式细胞检测细胞凋亡情况,对照组细胞凋亡率最低,NHAC组有所增加,伴随微粒浓度增加,细胞凋亡率明显增加。（4）碱性磷酸酶、茜红素染色、流式细胞检测钙离子浓度及免疫荧光化学分析均表明:随着钙化性纳米微粒浓度增加,ALP的表达、钙沉积、钙离子浓度以及细胞内OPN、BMP-2和TGF-β1/Smad3的蛋白表达均逐渐增加,体现出剂量依赖性;（5）Western-blot检测对钙化相关蛋白BMP-2、OPN和RUNX2,凋亡相关蛋白Bax、Caspse-3以及TGF-β1/Smad3信号通路关键蛋白检测均发现类似的剂量依赖性,即随着钙化性纳米微粒浓度增加蛋白的表达提升,并且各组之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:（1）钙化性纳米微粒作为一种钙化诱导剂,通过激活TGF-β1/Smad3信号通路促进间充质干细胞向成骨样细胞表型转化,充分抑制间充质干细胞的增殖促进其凋亡,持续性引发细胞内的钙代谢紊乱,诱导细胞钙化加剧,并且体现出剂量依赖性。（2）钙化性纳米微粒对间充质干细胞在增殖、凋亡、钙化等方面作用强于纳米级羟基磷灰石。
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