论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是一种最常见的神经退行性运动障碍疾病,该病的特征是依赖年龄的静止性震颤,肌肉强直,躯体麻痹,经多巴胺的前体左旋多巴(L-dopa)治疗后症状减轻。在年龄大于65岁的德国Bavarian人群中,PD的发病率为0.71%;在年龄大于50岁的新加坡人中,PD的发病率大约为0.30%。PD的病理学特征为黑质致密部多巴胺能神经元缺失,以及在剩余的多巴胺能神经元中出现泛素阳性的Lewy小体。迄今在染色体上已发现至少有九个位点与家族性PD相关,分别为PARK1-PARK9,PARK13,其中PARK1与PARK4为同一位点4q21。已克隆的PD相关基因有7个,其中α-synuclein、UCH-L1、LRRK2和Omi/HtrA2基因的突变可导致常染色体显性(autosomal dominant,AD)遗传PD,parkin、PINK1和DJ-1基因的突变则导致常染色体隐性(autosomal recessive,AR)PD。LRRK2基因有51个外显子,编码的蛋白多达2527个氨基酸,包含ANK、LRR、ROC、COR、Kinase和WD40等多个结构域。已经发现的PD相关突变在LRRK2的各个结构域中均有分布,尤以位于Kinase结构域的G2019S最为常见。LRRK2的分子量大约280KD,在脑和其它器官以及细胞系HEK293T中均可表达,功能尚不清楚。已有的研究表明,LRRK2R1441C、G2019S、I2020T等PD相关突变导致LRRK2激酶活性上升,细胞生活力下降,说明这些突变对细胞是有毒性的。而且,LRRK2参与调节神经元突起的形态建成,并在突触囊泡蛋白的极性分布中起重要的作用。Anti-LRRK2抗体是研究LRRK2功能重要的、必须的工具。通过DNAstar的Protean软件分析LRRK2的氨基酸序列,选择了三段长度在100个氨基酸左右、抗原性强、亲水性好的多肽片段,将其编码的核苷酸序列构建至原核表达载体pGEX-4T-2,原核表达和纯化得到了GST融合蛋白,然后免疫新西兰雄兔,获得了效价高、特异性好的anti-LRRK2兔多克隆抗体。抗体用途分析实验表明,该抗体可用于Western Blotting,免疫组织化学,免疫细胞染色等实验。利用自制的anti-LRRK2抗体,绘制出了LRRK2在小鼠脑中的分布图,发现LRRK2在鼠脑中是广泛表达的,但各神经解剖学部位间有重要的不同;Western Blotting的结果表明LRRK2在大鼠脑各部位均可表达;在HEK293细胞中LRRK2与线粒体标志物细胞色素C可以共定位。另外,序列比对的结果表明LRRK2与LRRK1的氨基酸序列是高度同源的。