肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病之一,对于肿瘤患者来说早发现早治疗是提高生存率和改善预后的重要手段,然而现阶段有关肿瘤标志物的检测方法普遍存在灵敏度低、操作繁琐、费用昂贵等弊端,因此,亟需探索和建立高效、灵敏、简单、快速的肿瘤标志物检测新方法。目前,纳米孔或者纳米通道在生物传感与生化分析领域引起了广泛兴趣。由于纳米通道的结构特性,可以通过离子电流展现分子几何变化使它在疾病标志物灵敏检测及疾病早期诊断的作用越来越明显。其中,多孔阳极氧化铝（Porous anodized aluminum,PAA）薄膜纳米通道在生化分析及生物传感器方面具有许多优点:可调纳米孔直径、良好的纳米通道阵列、易于表面功能化和商业可用性等。因此本论文利用阳极氧化铝薄膜纳米通道作为肿瘤标志物检测的载体,并且在其表面和内部通过非共价键修饰APTES连接上氨基,再进一步修饰有醛基的DNA链进行共价反应,然后将需要的信标链修饰在PAA膜表面形成一层致密的阻碍层,可以通过影响通道中的空间位阻或静电位阻从而实现电化学信号的差异以达到灵敏、高效、快速检测肿瘤标志物的目的。具体内容如下:1.通道中DNA纳米花的生成及对miRNA的检测新方法电化学方法具有成本低、灵敏度高、操作简单等性能,且信号输出方式直观。因此,在本论文中,我们利用电化学技术基于阳极氧化铝薄膜纳米通道内部生成DNA纳米花实现了肿瘤标志物miRNA的超灵敏检测。首先在PAA通道内部修饰一个与microRNA-21（miR-21）互补的捕获链（proDNA）。当靶标miR-21存在的时候可以使预先加入的带有引物Primer的环状DNA模板触发滚环反应（rolling circle amplication,RCA）生成DNA纳米花。这些DNA纳米花的绽放会在很大程度上增加纳米通道的空间位阻。同时,DNA磷酸基的负电性也可以引起静电位阻。这两个因素可明显降低由铁氰化钾K3[Fe（CN）6]从通道上部经过通道流入铂片工作电极的阳极电流,进而产生了较大的电化学信号差异。进一步研究表明电化学材料铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）信号的变化,可以得出阳极电流比的衰减与miRNA水平的线性差异。miRNA检测范围为10-1000 fM,最低检测限为4.53 fM,实现了对miRNA简单、灵敏、特异的检测,因而在未来临床诊断方面具有十分广阔的潜在应用前景。2.通道表面胶原-DNA聚合物的切割及MMP-2的检测新方法本论文本部分工作中,我们首先在阳极氧化铝薄膜的表面修饰一段含有醛基的DNA S1链,通过杂交修饰其互补DNA S2链。然后将修饰有双链DNA的阳极氧化铝薄膜插入胶原样多肽溶液中,使胶原样多肽通过静电作用和氢键作用与双链DNA结合,在阳极氧化铝薄膜表面形成胶原-DNA聚合物。由于多肽胶原可作为基质金属蛋白酶（MMP-2）的底物,因此基于阳极氧化铝薄膜,我们构建了灵敏检测MMP-2的生物传感器。具体而言,当多肽胶原被MMP-2切割后,阳极氧化铝薄膜表面空间位阻大大减小,使得电化学响应增强,该电化学响应的改变即可用于MMP-2的电化学检测。检测范围为10-20000 pg/μL,最低检测限2.5pg/μL,我们的检测方法更加便捷高效,并且不需要复杂的完整的蛋白质底物,利用多肽就可替代底物实现MMP-2灵敏高效的分析,因而在生物传感领域具有极好的应用潜力。