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脓毒症在非冠状疾病重症监护室患者死亡原因中位列第一，而全球每年有 315万脓毒症患者，死亡率高达20%。脓毒症是病原体侵入机体导致出现全身炎症反应及器官功能障碍的临床综合症。脓毒症的先决条件是感染诱发的，其作用机制是机体早期以制衡过度炎症反应、保护机体为目的的免疫调节，而免疫失调被认为是脓毒症病程中的主要病理生理机制之一。如何充分利用现有医疗资源，继续挖掘新的治疗手段，无疑是当前要紧的任务。 近些年来，国内外学者先后发现，电针在脓毒症和脑缺血疾病具有保护作用。且这一作用依赖于胆碱能抗炎通路完成，然而具体机制尚未完全阐明。α7nAchR激动剂能减少巨噬细胞炎症因子释放，这一作用发生在转录后水平。研究报道， miRNA146 在炎症反应中以负反馈形式参与了多种致炎基因和转录因子的表达与抑制。那么，miRNA146 在电针激活胆碱能抗炎通路抗炎过程中是否通过其负反馈调节机制发挥了作用呢？ 因此，本实验旨在探索 miRNA146 上调是否在电针治疗脓毒症过程中扮演重要作用，以及其中的具体机制，为脓毒症的发病机制和开发新的临床治疗手段提供理论依据和证据支持。 实验一 验证胆碱能抗炎通路在介导电针减轻脓毒症小鼠炎症反应中的作用 目的 证实电针通过激活胆碱能抗炎通路对脓毒症小鼠具有保护作用 方法 1.分组：雄性C57BL/6小鼠104只，分为假手术组（sham组，n=26）、CLP组（n=26）、电针+CLP组（CLP+EA组，n=26）、电针+CLP+MLA足（EA+CLP+MLA组，n=26）。其中MLA是α7nAchR抑制剂，抑制胆碱能抗炎通路在体激活。 2.电针：脓毒症造模前电针，穴位取双侧“足三里”穴，持续电针 45min，电针刺激参数为：疏密波，频率 2Hz，1mA。其中 CLP+EA+MLA 组电针造模前给予腹腔注射胆碱能受体抑制剂MLA5mg/kg。 3.观察检测：各组小鼠行盲肠结扎穿刺术造模，每组取20只小鼠观察7天生存率， 24h后剩余各组6只心脏采血检测促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6及HMGB1水平。 结果 与CLP组比较，EA+CLP组脓毒症小鼠生存率明显提高，促炎因子水平明显下降；与EA+CLP组比较，CLP+EA+MLA组脓毒症小鼠生存率明显下降，促炎因子水平明显升高。 结论 电针通过激活胆碱能抗炎通路可以减轻脓毒症小鼠炎症反应 实验二 胆碱能抗炎通路激活对巨噬细胞miRNA146及促炎因子的影响 目的 观察胆碱能通路激活条件下巨噬细胞miRNA146以及促炎因子的变化 方法 1.分组:RAW264.7巨噬细胞随机分为3组，对照组、LPS组和LPS+GTS-21组，其中LPS浓度为100ng/ml,GTS-21浓度为10umol/L。 2. 检测:GTS-21给药2h后，给予LPS刺激。2h后ELISA检测细胞培养上清液TNF-α、IL-1β和 IL-6 水平；给药 18h后，Western Blot 检测巨噬细胞内 HMGB1表达，qRT-PCR检测巨噬细胞内miRNA146水平。GTS-21是胆碱能通路激活剂。 结果 与对照组相比，LPS组促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6明显升高，而HMGB1和miRNA146水平亦有明显升高（均P＜0.05）；与LPS组比较，使用了胆碱能抗炎通路激活剂的LPS+GTS-21组的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1明显降低，而miRNA146却有明显升高（均P＜0.05）。 结论 LPS刺激条件下，巨噬细胞释放促炎因子和miRNA146明显增加；而激活胆碱能抗炎通路在降低促炎因子的同时，可以明显升高miRNA146水平。 实验三 在脓毒症小鼠观察电针激活胆碱能抗炎通路后对miRNA146水平的影响 目的 证实电针通过激活胆碱能抗炎通路上调了脓毒症小鼠血浆miRNA146水平 方法 1.分组:雄性C57BL/6小鼠24只，分为假手术组（sham组，n=6）、CLP组（n=6）、电针+CLP组（CLP+EA组，n=6）、电针+CLP+MLA组（CLP+EA+MLA组，n=6）。其中MLA是α7nAchR抑制剂，抑制胆碱能抗炎通路在体激活。 2.电针:脓毒症造模前电针，穴位取双侧“足三里”穴，持续电针45min，电针刺激参数为：疏密波，频率 2Hz，1mA。其中 CLP+EA+MLA 组电针造模前给予腹腔注射胆碱能受体抑制剂MLA 5mg/kg。 3.检测:CLP造模24h后用qRT-PCR检测血浆miRNA146水平。 结果 与sham组比较，CLP组miRNA146水平显著上升；与CLP组比较，EA+CLP组miRNA146水平明显升高；与CLP组比较，CLP+EA+MLA组miRNA146水平显著下降（均P＜0.05）。 结论 脓毒症小鼠miRNA146 水平明显升高，而电针可以更一步显著提高脓毒症小鼠血浆miRNA146水平。 实验四 巨噬细胞miRNA146在胆碱能抗炎通路中的作用 目的 证实胆碱能抗炎通路依赖于miRNA146上调而发挥抗炎作用 方法 1. 分组:将RAW264.7巨噬细胞随机分为4组，LPS组、LPS+GTS-21组+空载体组、LPS+GTS-21+anti-miRNA146组和LPS+GTS-21+高表达miRNA146组，其中LPS浓度为100ng/ml,GTS-21浓度为10umol/L。 2. 转染:从公司购买构建载体包装提纯的慢病毒 anti-miRNA146、高表达miRNA-146，对细胞转染72h。 3. 检测:GTS-21给药2h后给予LPS刺激。2h后，ELISA检测细胞培养上清液TNF-α、IL-1β和IL-6水平；18h后，Western Blot检测巨噬细胞内HMGB1表达，ELISA检测细胞上清液HMGB1水平，qRT-PCR检测巨噬细胞内miRNA146水平。 结果 1.与LPS组比较，给予GTS-21后的LPS+GTS-21+空载体组促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1明显降低，而miRNA146明显升高（P＜0.05）； 2.与 LPS+GTS-21+空载体组比较， LPS+GTS-21+anti-miRNA146 组促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1明显升高，而miRNA146明显下降（P＜0.05）； 3.与LPS+GTS-21+空载体组比较，LPS+GTS-21+高表达miRNA146组促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1下降明显，而miRNA146明显升高（P＜0.05）。结论 激活胆碱能通路导致miRNA146上调，后者有助于抑制了炎症反应发生。 实验五 miRNA146在电针通过激活胆碱能抗炎通路减轻脓毒症小鼠损伤中的作用 目的 证实电针激活胆碱能抗炎通路是通过上调 miRNA146 可以降低脓毒症小鼠死亡率、减轻全身炎症反应和脏器损伤 方法 1.分组:将104只小鼠随机分为4组，分别为CLP组（n=26）、电针+CLP组（n=26）、电针+CLP+anti-miRNA146组（n=26）和电针+CLP+高表达miRNA146组（n=26）。取每组20只做生存率分析，剩余6只做其他检测。 2.转染:从公司购买构建载体包装提纯的慢病毒 anti-miRNA146、高表达miRNA-146，尾静脉注射小鼠体内，7天后开始用于电针处理。 3.电针: 脓毒症造模前电针，穴位取双侧“足三里”穴，持续电针45min，电针刺激参数为：疏密波，频率2Hz，1mA。 4.检测: 1）生存率分析 统计1、2、3、5和7天生存率，利用Kaplan Meier分析构图。 2）取重要脏器做病理学评估 取小鼠肝、肺、肾组织做HE染色，统计分析结果。 3）Western blot检测血清HMGB1表达，qRT-PCR检测血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平。 结果 与CLP组比较，EA+CLP组小鼠生存率显著上升，且脏器损伤和全身炎症反应明显减轻；与EA+CLP组比较，EA+CLP+anti-miRNA146组生存率明显下降，且脏器损伤和全身炎症反应明显增强；与EA+CLP组比较，EA+CLP+高表达miRNA146生存率明显上升，且脏器损伤和全身炎症反应明显减轻。 结论 电针激活胆碱能抗炎通路后上调 miRNA146 表达，后者明显提升了脓毒症小鼠的生存率、减轻其脏器损伤和全身炎症反应。