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目的1.构建并鉴定含人脂联素(Human adiponectin,Human adipose most abundant gene transcript 1,HapM1 )基因的重组慢病毒载体;2.从大鼠脂肪组织中分离、培养具干细胞标志的基质血管组分(Stromal vascular fraction,SVF)细胞, HapM1基因修饰SVF细胞;检测HapM1在SVF细胞中的表达;3.探讨HapM1基因修饰的SVF细胞移植对大鼠心肌梗死的影响,观察移植细胞的存活、分化情况。方法1. HapM1基因重组慢病毒载体质粒的构建及鉴定(1)根据Genbank中HapM1基因序列,设计上下游引物,通过RT-PCR方法扩增目的基因片段,通过TA克隆筛选正确的重组体,进行酶切鉴定和测序。(2)通过双酶切和基因重组亚克隆构建HapM1重组慢病毒载体质粒pNL- HapM1-IRES2-EGFP,经抗生素筛选后,进行酶切鉴定和测序。2. HapM1基因修饰SVF细胞(1)通过脂质体介导慢病毒三质粒系统共转染293T细胞包装慢病毒,收集病毒进行超速离心浓缩。PCR鉴定病毒基因组中目的基因HapM1的插入。(2)通过胶原酶消化分离和贴壁培养相结合的方法在体外提取、传代培养大鼠脂肪组织中的SVF细胞,并经免疫荧光法检测CD31、CD34表达情况。(3)将慢病毒感染SVF细胞,通过荧光显微镜观察报告基因增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达,细胞RT-PCR检测HapM1的mRNA表达,Western blot检测HapM1蛋白的表达,内皮细胞划痕迁移实验检测所表达HapM1蛋白的生物学活性。3. HapM1基因修饰的SVF细胞移植对心肌梗死的疗效观察(1)结扎冠状动脉左前降支建立大鼠心肌梗死模型,观察心电图变化验证模型的成功与否,然后心肌局部移植基因修饰的SVF细胞。(2)移植4周后通过超声心动图及血流动力学检测评定心功能。(3)心脏切片HE染色观察各组大鼠心肌的组织学变化。(4)荧光显微镜下观察移植细胞的存活和分布,通过CTNI抗体的免疫荧光染色观察移植细胞在心肌中的分化情况,通过HapM1抗体的免疫荧光染色观察目的蛋白在心肌中的表达情况,通过对Ⅷ因子相关抗原的免疫荧光检测测定血管内皮密度。结果1.获得了长度为735bp的HapM1目的基因片段,HapM1基因重组慢病毒载体质粒pNL-HapM1-IRES2-EGFP经双酶切后凝胶电泳鉴定正确,测序结果与Genbank报道序列完全一致。2. HapM1基因修饰SVF细胞(1)三质粒共转染293 T细胞包装慢病毒后荧光显微镜下观察可见较强绿色荧光,重组慢病毒经PCR鉴定有目的基因条带。(2)通过胶原酶消化分离和贴壁培养相结合的方法获得了SVF细胞,免疫荧光检测显示CD31阴性、CD34阳性。(3)SVF细胞受慢病毒感染后,荧光显微镜下可见绿色荧光,RT-PCR、Western blot检测到有HapM1转录和表达,所表达的HapM1蛋白具有促进内皮细胞迁移的生物学活性。3. HapM1基因修饰的SVF细胞移植对心肌梗死的疗效观察(1)经SVF细胞移植治疗的心肌梗死大鼠的心脏功能和组织学的恢复都好于对照组。HapM1基因修饰的SVF细胞移植治疗的心肌梗死大鼠心脏功能和组织学恢复状况明显优于单纯SVF细胞治疗组。(2)移植的SVF细胞可存活于心肌缺血损伤部位。EGFP标记的SVF细胞移植后在缺血心肌组织中有局部分布。(3)免疫荧光染色发现部分的SVF细胞表达心肌的特异标志物CTNI。(4)免疫荧光染色显示,SVF细胞移植后心梗区心肌组织Ⅷ因子相关抗原表达明显增高。结论1.成功构建含目的基因HapM1和报告基因EGFP的重组慢病毒载体pNL-HapM1-IRES2-EGFP,成功包装含目的基因HapM1的重组慢病毒。2.成功对SVF细胞进行HapM1基因修饰,功能基因HapM1和报告基因EGFP在SVF细胞上均获得表达,为HapM1基因修饰的SVF细胞治疗研究提供直观的检测手段。3. HapM1基因修饰的SVF细胞有HapM1基因转录和蛋白表达,所表达的HapM1蛋白具有促进内皮细胞迁移的生物学活性。4. HapM1基因修饰的SVF细胞可在心肌损伤部位存活,分化表达心肌细胞标志物。5. HapM1基因修饰的SVF细胞移植治疗能够更好地改善心肌梗死大鼠心脏功能和促进组织学恢复。