论文部分内容阅读
蛋白激酶又称蛋白质磷酸化酶。作为细胞信号转导途径的重要的中间分子，蛋白激酶在生物体内发挥了重要的作用。细胞在受到外界信号刺激后，会激活蛋白激酶的活性，并使下游蛋白质磷酸化，从而实现细胞信号的转导。CDK2作为一种细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-Dependent Kinasas, CDKs），在与特定的细胞周期蛋白Cyclins结合后被激活，然后使下游一些重要周期蛋白磷酸化，从而调控着细胞周期的运行。临床研究发现CDK2的过量表达会导致肿瘤的发生。本文通过原核和真核两种表达体系即大肠杆菌和毕赤酵母对cdk2基因进行诱导表达，对两种体系中表达的目的蛋白分离纯化并进行定性定量的检测分析。通过比较，选择表达量高及表达蛋白稳定性更好的宿主进行大量表达和纯化，将纯化后的蛋白用于结晶。主要的研究内容和结果如下：1.以质粒cdk2为模板，利用聚合酶链式反应扩增出cdk2的全长cDNA，构建大肠杆菌原核表达载体pET28a(+)-GST-TEV-cdk2和毕赤酵母真核表达载体pPIC3.5K-cdk2及pPIC9K-cdk2。前两种表达载体是胞内表达载体，后一种是分泌性表达载体。将pET28a(+)-GST-TEV-cdk2转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）Rosetta中，然后用异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。pPIC3.5K-cdk2和pPIC9K-cdk2分别用限制性酶线性化后电击转化毕赤酵母GS115，筛选阳性克隆进行甲醇诱导蛋白表达。2.用Ni-NTA Resin和凝胶层析纯化目的蛋白，表达产物用SDS-PAGE和Western-Blot分析鉴定。结果表明重组蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中均获得正确可溶性表达，且大肠杆菌中表达产量是4.68mg/L，毕赤酵母中表达产量是6.04mg/L。对胞外表达，则没有检测到目标产物。利用圆二色谱（Circular Dichroism, CD）对在两种表达体系中表达纯化的目的蛋白进行折叠构象分析，结果表明毕赤酵母中表达的目的蛋白的有效折叠率是63.9%，大肠杆菌中表达的目的蛋白的折叠率是13.7%。3.对毕赤酵母胞内表达目的蛋白分离纯化，得到的目的蛋白进行晶体培养，成功得到了蛋白质晶体。本文研究结果表明，与大肠杆菌比较，CDK2能够在毕赤酵母胞内更高效，更稳定的表达。毕赤酵母表达体系为CDK2的大量表达纯化以及结构功能的研究提供了强有力的基础。