研究背景:肺癌作为全球性的恶性肿瘤之一,病因非常复杂,吸烟、大气污染、慢性肺部疾患等都与肺癌的发生密切相关。有研究表明,COPD是诱发肺癌的独立危险因素,肺癌与COPD是吸烟相关的同源性疾病,甚至也是一种慢性炎症相关性疾病。慢性炎症主要通过激活多种蛋白及细胞因子组成复杂的分子网络,通过多种内源性和/或外源性信号通路引起慢性炎症向癌症转化。因此EGFR信号通路作为重要的细胞代谢调控通路之一,多个节点或细胞因子已成为临床上肿瘤靶向治疗的重要靶点。但其临床有效率往往不到20%。提示在肿瘤的发生发展以及对药物敏感性等方面可能存在多个信号通路的相互作用。其中Hedgehog(HH)信号通路的作用越来越受到人们的重视。Hedgehog信号通路由配体HH,受体PTCH和SMO、转录因子GLI及SUFU等多种调控因子组成。已经有人在多种恶性肿瘤组织中检测到增高的Hedgehog信号通路蛋白。根据现有的研究进展,在恶性肿瘤细胞中Hedgehog信号通路活化的机制有几种可能,(1)Hedgehog配体的自分泌或旁分泌增多,可能与基因突变有关,或与其他信号通路活性增强有关;(2)PTCH突变;(3)SMO突变;(4)Sufu突变;(5)GLI基因突变等。此外,亦不除外因为其他相关信号通路的异常激活而刺激了本通路信号转导蛋白的过渡表达的可能。因此,到目前为止,在慢性炎症导致的肺炎癌转化过程中该通路的基因突变、蛋白表达情况及其相互作用机制还有待进一步研究。本研究从摸清Hedgehog信号通路在临床非小细胞肺癌(NSCLC)患者病理组织中的实际表达情况入手,通过筛查NSCLC组织中Hedgehog信号通路基因突变的临床研究、基于微流控芯片技术COPD发生炎-癌转化模型的制备及HH信号通路的体外研究以及基于炎-癌转化细胞的成瘤裸鼠模型制备及Hedgehog信号通路功能的体内研究三个部分,探讨非小细胞肺癌组织中Hedgehog信号通路相关节点基因表达情况及调控措施,进而为明确Hedgehog信号通路在肿瘤发生发展中的作用及相关效应蛋白的调控奠定基础。目的:1.探讨HH信号通路相关蛋白在非小细胞肺癌中基因突变情况并与传统EGFR信号通路相比较,以便了解HH信号通路在非小细胞肺癌组织中的活性程度;2.探讨HH信号通路相关蛋白在COPD发生肺炎癌转化过程中的表达情况;探讨HH信号通路信号蛋白相关抑制因子对肺炎癌转化过程的抑制作用;3.利用已胸腺敲除的裸鼠,探讨发生炎癌转化后的支气管上皮细胞的成瘤性,并检验HH信号通路信号蛋白相关抑制因子对转化细胞成瘤性的抑制效果。4.建立高通量、集成化、消耗少和速度快的微流控检测芯片,以此为技术平台在同一体系下对多种因子进行联合监测,以提高检测的高效性、准确性和可靠性。方法:1.从非小细胞肺癌石蜡病理切片中提取DNA,提纯后基因测序法检测HH信号通路蛋白的基因突变情况。从分子水平了解非小细胞肺癌细胞中HH信号通路的活性并与EGFR信号通路的活性相比较。(1)从本院病理库中随机选取非小细胞肺癌病理组织蜡块共40例,石蜡切片(取8张/例),手术刀刮取约30 mg的组织样本(尽量去除多余的石蜡)。石蜡基因组提取试剂盒提取DNA待检。(2)针对SHH、PTCH1、PTCH2、SMO、SUFU、EGFR、KRAS、PI3K等8个基因的外显子设计相应的扩增引物,第二代基因测序方法检测PTCH1等Hedgehog/EGFR信号通路蛋白基因在非小细胞肺癌组织中的突变情况,并加以比较。2.用PDMS(Polydimethylsiloxane)为原料用标准软光刻法制作含有浓度梯度发生器的芯片A和含有多通道多细胞培养池的芯片B。在含有浓度发生器的芯片A中按105细胞/室接种细胞,细胞贴壁后24h,将完全培养基和CSE溶液分别以7μl/min和5μl/min的速度泵入芯片,经浓度梯度发生器产生6个不同的浓度分别刺激支气管上皮细胞48h后,用Hoechst33342染色20分钟,放在倒置荧光显微镜下(Olympus IX71,日本,放大200倍)观察细胞凋亡情况,以细胞生存率达80%以上时的最大浓度为最佳刺激浓度。使用该浓度长期刺激培养在微流控芯片B中的人支气管上皮细胞,从而建立体外肺炎癌转化模型。Westernblotting检测Hedgehog信号通路蛋白在肺上皮细胞炎癌转化不同时期的表达情况。3.在用芯片B建立的体外肺炎癌转化模型的基础上,探讨Hedgehog信号通路蛋白拮抗剂环靶明对Hedgehog信号通路蛋白表达及CSE刺激支气管上皮细胞发生炎癌转化过程的抑制作用。4.通过裸鼠致瘤性实验,将刺激后发生转化的支气管上皮细胞接种到胸腺敲除裸鼠的左前腋下,观察转化细胞的成瘤性,同时检测HH信号通路相关信号相关抑制因子环靶明对转化细胞成瘤性的影响。结果:1.将突变临界设定为5%水平,在对40例非小细胞肺癌组织中Hedgehog/EGFR信号通路蛋白的基因突变的筛查中,共检测出包括单核苷突变、插入/缺失突变在内的各类总突变位置138个,数据库中有注册rs ID的突变98个,其中单核苷酸突变86个,缺失突变6个,插入突变3个。在临床突变数据库clinvar有注释的突变19个。主要集中在EGFR,KRAS,PTCH1和PTCH2四个基因。具有临床注释的19突变位点中,EGFR有6个,KRAS有4个,PTCH1为2个,PTCH2有4个,SUFU有3个。其中与致肿瘤有关或与靶向治疗有关的突变主要集中在EGFR,KRAS和PTCH2上,趋势上看以EGFR为主,但无统计学差异(P>0.05)。2.通过浓度筛选,最终选择的CSE刺激浓度以12.25%。通过近8个月的刺激,支气管上皮细胞的细胞形态与正常对照相比发生了根本变化,细胞核明显增大,染色体增粗,细胞失去极性,以没有显著突变的SMO和GLI为Hedgehog信号通路活化代表的蛋白较正常细胞表达明显增高(P<0.05)。而这一现象能够被Hedgehog信号蛋白抑制剂环靶明显著抑制(P<0.05)。3.经CSE长期刺激后的转化细胞可以在裸鼠皮下生长成为肿瘤,但这种生长能被环靶明显著抑制(P<0.05)。结论:1.Hedgehog/EGFR两个信号通路突变活性趋势上看以EGFR占优,但在有限样本范围内,二个通路之间没有统计学差异(P>0.05),提示二者在肺癌的发生发展中都可以独立决定肿瘤的生成与发展。2.Hedgehog信号通路蛋白的基因突变主要集中在PTCH2和PTCH1上,其次是SUFU,而后者突变未发现临床意义,而SHH、SMO、GLI几乎没有有效突变产生。因此,作为SMO抑制剂的环靶明可能有效抑制Hedgehog信号通路的活性。3.在CSE长期刺激的支气管上皮细胞炎癌转化过程中Hedgehog信号通路蛋白表达明显增高,而这一现象能够被Hedgehog信号蛋白抑制剂环靶明显著抑制。同时转化后的细胞可以在裸鼠皮下生长成为肿瘤,同样这种生长过程也能被环靶明显著抑制,这些证据表明Hedgehog信号通路在肺癌的发生发展过程中具有重要作用。4.含有浓度发生器的芯片以及多细胞培养池的芯片系统具有高通量、集成化、消耗少和速度快的特点,可以作为连续生物培养和动态生物分子检测的检测技术平台,能够在同一体系下对多种因子进行高效、准确和可靠的联合监测。