研究背景和目的全球有超3.5亿人口感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV),而中国是一个HBV感染的大国,感染率约7.18%。肝细胞癌(HCC)在癌症死亡率中已跃升为第四位,男性患者是第三位,而HBV就是其主要病因。目前HBV血清学标志物(Hepatitis B Virus Serological markers, HBV-M)的检测普遍采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法。近来出现了时间分辨荧光分析技术(Time resolved fluorescence immunoassay,TRFIA)与化学发光免疫分析技术(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)检测]HBV-M(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb);在HBV-M检测领域还有免疫胶体金技术(Colloidal gold immunoassay,CGIA),放射免疫技术(Radioimmunoassay, RIA),等等。ELISA其优点是经济,成批检测时间不长,仪器设备要求不高,但准确性较差,且不能定量;TRFIA方法其优点是可定量,灵敏度与特异性较ELISA优越,但其检测时间较长,标本消耗量大；CLIA方法其优点是检测时间短,灵敏度与特异性高,但需配套的仪器设备与试剂,检测成本高；CGIV方法其优点是快速、不需仪器设备、单份测试成本低,但其灵敏度较低,难以进行质量控制；RIA方法其优点是灵敏度高,经济,但存在放射性污染。方法较多,不同的检测方法得出的结果有所差异,其差异随着人们对自身健康的关注而引起的医疗纠纷表现越来越突出。如乙肝病毒表面抗原(HBsAg)假阴性产生的输血安全问题,还有的问题如人们还没有意识到已感染HBV与肝炎,而未采取干预措施,如减少饮酒注意休息等一般措施和采取抗病毒治疗等特殊措施等从而发展为肝硬化肝癌等。如表面抗原为假阳性产生的最大问题是会使受检者加重心理负担,影响到婚姻、就业、家庭等。HBV的防治方案的合理选择,有赖于HBV血清标志物检测的准确。我国目前检测HBV-M主要有ELISA、TRFIA、电化学发光免疫分析(Electrical chemiluminescence Immunoassay,ECLIA)三种方法,因此,我们对三种方法的灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率、检测时间、标本消耗量等的比较来阐述三检测方法对HBV各血清标志物检测差异的程度及原因,从而分析各检测方法的优劣与应用价值；并基于我国目前实际情况探讨ELISA方法检测HBsAb的S／CO比值应用于免疫保护范围,以及ELISA测定低浓度HBsAg的函数判断结果的准确性。总之,只有HBV-M结果准确,才有更科学个性化的防治方案,使易感者得到有效保护,乙肝感染者能延缓肝硬化肝肿瘤的病程进展、甚至治愈。方法1. ECLIA, TRFIA, ELISA三种方法测定HBV血清标志物差异性比较452例标本来自2009年10月-2009年12月来我院就诊人员,其中男267例,女185例,年龄0岁-86岁,均龄41.2岁。第一部分来自分子生物学实验室(90例,均为肝炎患者,且已知FQ-HBV-DNA定量的结果),采取三种方法平行检测HBV-M。第二部分来自免疫定量实验室(182例),检测顺序为ECLIA、ELISA、TRFIA。第三部分来自免疫定性实验室(180例),检测顺序为ELISA、ECLIA与TRFIA平行检测。操作及结果判断严格按照说明书进行。ELISA以S／CO比值表示其量化程度,ECLIA的HBsAb为定量数据,其单位为mlU／ml；HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb四项则以COI(Cutoff index)指数来衡量量化程度,TRFIA测定结果均为定量结果,HBsAg的单位是ng/ml,HBsAb的单位是mIU/ml, HBeAg、HBeAb、HBcAb三项的单位是PEI U/ml。TRFIA、ELISA采用卫生部临检中心的质控品加强质量控制,而ECLIA以厂家的原装配套质控品加强质量控制。对三种方法检测HBsAg结果不一致的17例标本再采用表面抗原确认试剂以及采用HBV荧光PCR定量(FQ-HBV-DNA)再行确认。接着对ECLIA阴性、TRFIA阳性、FQ-HBV-DNA阳性的5例标本再采用Roche与Abbott两公司的ECLIA方法复查以确认是否为标本受到污染抑或为ECLIA检测突变能力以外的新突变体。2. ELISA方法S／CO比值应用于乙肝病毒表面抗体保护范围初探756例标本来自2008年8月～2009年10月我院查体人员,男480例,女276例,年龄0岁-86岁,均龄41.04岁。每份标本均用ELISA测定HBsAb,ECLIA测定HBsAb与HBsAg。操作及结果判断严格按照说明书进行；前者以S／CO比值表示其量化程度,≥1判为阳性,后者可直接定量,≥10IU／L判定为阳性。ELISA以10IU／L、30IU／L的HBsAb质控品加强质量控制,ECLIA以配套质控品加强质量控制。并以ECLIA为标准来评价ELISA测定HBsAb的特异性、灵敏度及其相关性。3. ELISA测定低浓度乙肝病毒表面抗原结果准确性函数判断收集2009年10月～2009年12月ELISA检测HBsAg的S／CO比值位于0.5～5.0之间的170份标本,23份组合模式奇特且HBsAg的S／CO比值≤11.0的标本(男125例,女68例,年龄0-81岁,均龄41.4岁,其中10例为新生儿)。COBASe601平台检测HBsAg后,置-20℃低温冰箱保存。标本收集完毕后从ECLIA复查HBsAg阳性中随机抽取40例作表面抗原中和确认实验。分析ELISA测定HBV-M的组合模式；并以HBsAg为因变量,ELISA测定的HBV-M五项以及年龄、性别为自变量进行多因素Logiest回归,得出回归方程。根据回归方程计算的P值从而初步判断ELISA方法测定HBsAg的结果是否准确。4.统计学方法采用Excel电子表格软件进行数据登记,SPSS 16.0统计分析软件进行分析。ELISA、TRFIA、ECLIA检测HBV-M的阳性率其差异采用Pearson卡方检验,两两比较则采用partitions of X2 method,一致性检验检验采用Kappa检验。ELISA和ECLIA测定同一份标本的HBsAb结果配对,其差异采用McNemar卡方检验,一致性检验检验采用Kappa检验,相关性分析采用直线回归。ELISA和ECLIA测定同一份标本的HBsAg结果配对,其差异采用McNemar卡方检验,一致性检验检验采用Kappa检验；再以ECLIA测的HBsAg为因变量、ELISA测定的HBV-M为自变量进行Logiest回归。检验水准a=0.05。结果1.ECLIA、TRFIA、ELISA三种方法测定HBV血清标志物差异性比较ELISA、TRFIA、ECLIA测定HBsAg、HBsAb、HBeAg的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；经Kappa检验HBsAg、HBsAb、HBeAg在任两方法之间均具有极好的一致性(Kappa>0.75)。HBeAb、HBcAb的阳性率差异有统计学意义(P<0.05)；HBeAb的阳性率TRFIA方法最高、ELISA最低、ECLIA居中；而HBcAb的阳性率则ECLIA方法最高、ELISA最低、TRFIA居中。经partitions of X2 method检验发现HBeAb的阳性率ELISA与TRFIA、ELISA与ECLIA的差异有统计学意义(P<0.0125),一致性均较差(Kappa<0.75)；而ECLIA与TRFIA则无统计学差异(P>0.0125),一致性较好(Kappa>0.75)。经partitions of X2 method检验发现HBcAb的阳性率ELISA与TRFIA、ELISA与ECLIA、ECLIA与TRFIA的差异均有统计学意义(P<0.0125),一致性较差(Kappa<0.75)。ELISA、TRFIA、ECLIA检测HBsAg的结果同为阳性175例,同为阴性260例,总符合率为96.24%,其差异无统计学意义(P>0.05)。从本实验可观,有5例(2.75%)标本发生交叉污染,均为第二类标本,又从操作程序与原始记录可查出污染来自于ELISA检测系统。由FQ-HBV-DNA和中和确认试验综合考虑,则ELISA方法的HBsAg有4例(2.22%)假阴性、1例(0.04%)假阳性,灵敏度97.22%,特异度99.63%；TRFIA则有3例(1.67%)假阴性、4例(1.47%)假阳性,灵敏度97.78%,特异度98.53%；ECLIA则有0例(0.00%)假阴性、0例(0.00%)假阳性,灵敏度100.00%,特异度100.00%。ELISA、TRFIA、ECLIA检测HBsAb的结果三者均阳性207例,三者均阴性193例,总符合率88.50%；HBeAg的结果同为阳性46例,同为阴性390例,总符合率为95.58%；HBeAb的结果均阳性167例,均阴性192例,总符合率为79.42%；HBcAb的结果同为阳性261例,同为阴性66例,总符合率为72.35%。2. ELISA的S／CO比值应用于乙肝病毒表面抗体保护范围初探ELISA与ECLIA测定HBsAb的结果同为阳性349例,同为阴性337例,符合率为90.74%,经Kappa检验其值为0.815,说明ELISA与ECLIA方法检测HBsAb具有较好的一致性。21例ECLIA阴性而ELISA为阳性,占2.78%；49例ECLIA阳性而ELISA阴性,占6.48%。HBsAg阴性的453例标本中,ELISA测定HBsAb的S／CO值<1.0的有98例,其中81例ECLIA测定小于10mIU／ml,均为阴性结果,一致性82.7%；17例大于10mIU／ml。ELISA方法测定HBsAb的S／CO值介于1.0～5.0的有86例,其中72例ECLIA法测定在10-100 mIU／ml之间,均为弱阳性结果,一致性83.7%,这部分受检者对HBV的免疫保护作用不确切；有11例小于10mIU／ml和3例大于100 mIU／ml。ELISA方法测定HBsAb的S／CO值介于5.0-13.0有69例,40例ECLIA法测定大于100mIU／ml,均为阳性结果,一致性58.0%,这部分受检者对HBV的具有免疫保护作用；还有29例在10～100 mIU／ml之间。ELISA方法测定HBsAb的S／CO比值大于13.0有200例,ECLIA法测定则有199例大于100mIU／ml,均为阳性结果,一致性高达99.5%,基本所有受检者对HBV均具有肯定免疫保护作用。3. ELISA方法测定低浓度乙肝病毒表面抗原结果函数判断初探ELISA检测低浓度HBsAg的149份阳性标本用ECLIA复查有112例为阳性；37例为阴性,假阳性率19.17%。ELISA检测低浓度HBsAg的44份阴性标本用ECLIA复查有28例为阴性；16例为阳性,假阴性率8.29%。两方法检测低浓度HBsAg总符合率仅72.54%,经Kappa检验其值为0.332,说明ELISA与ECLIA检测低浓度HBsAg一致性较差；经McNemar卡方检验其差异有统计学意义(x2=8.321,P=0.005)。40例ECLIA复查阳性经表面抗原中和试验确认均为阳性,92例FQ-HBV-DNA确认有5例阳性,占5.43%。排除10例新生儿后的183例标本Logiest回归第一次迭代拟合后的阴性预测准确度为86.0%,阳性预测准确度为98.4%,对所有个案预测准确度为94.5%。-2对数似然值为58.224,Nagelkerke R2为0.848。Logiest回归方程为：结论1.ELISA与TRFIA检测HBsAg具有一定的假阳性和假阴性,但三种检测方法检测的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；三种方法检测HBsAb与HBeAg的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；而HBeAb、HBcAb的阳性率有统计学差异(P<0.05)。2.与ECLIA相比,ELISA测定的HBsAb具有肯定的免疫保护作用的S／CO比值为大于13.0；不具有免疫保护作用的S／CO比值为<5.0。3.在没有ECLIA复查ELISA测定低浓度HBsAg的情况下,可利用函数求出的P值推断结果的准确性,以P=0.5为临界点,P值越大,阳性预测准确度越高, P值越小,阴性预测准确度越高。创新点1.首次提出ELISA测定HBsAb的S／CO值可半定量,人们可据HBsAb检测S／CO值的范围,初步判定是否需重新或加强免疫,使ELISA的检测结果具有ECLIA定量的初步价值。2.首次提出ELISA测定低浓度HBsAg标本初步判断结果准确性的数学函数表达式。