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HER2(p185erb B2/neu)是EGFR家族的成员,在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤细胞中高表达,是肿瘤恶性行为以及不良预后的标志。靶向治疗是HER2阳性肿瘤的重要治疗手段,主要包括靶向HER2的单克隆抗体、单链抗体偶联效应分子等策略。HER2治疗性单克隆抗体能够有效抑制肿瘤细胞增殖、延长生存期,是HER2阳性进展期乳腺癌及胃癌的一线疗法。这些HER2靶向的治疗性抗体都由鼠源单克隆抗体经人源化改造而来,长期应用未观察到严重的免疫原性相关副作用。HER2单链抗体来源于单克隆抗体,常与生物效应分子融合表达或者表达于T细胞表面（CAR-T）靶向杀伤肿瘤细胞,具有广泛的应用价值。对鼠源单链抗体的人源化改造,是以其为基础的肿瘤靶向杀伤策略走向临床的重要一环。本研究以本组前期系列验证的、靶向效果明确的鼠源单链抗体e23sFv为模板,拟解决两个关键问题:一是在探索单链抗体人源化的技术改进;二是评价该人源化单链抗体用于肿瘤靶向治疗的有效性。针对第一个关键问题,本研究进行了两方面新的摸索。首先,在传统的鼠源互补决定区（CDR）—人源框架区（FR）移植策略的基础上,拓宽了人源化改造FR模板的选择范围,既选了与e23sFv同源性最高的全人抗体特异序列,也选了与e23sFv同源性最高的全人抗体亚类的通用序列,并将二者对比,为抗体人源化的FR模板选择提供线索。其次,针对所选的人源抗体亚类通用序列,将FR关键残基突变回鼠源亲本,以维持抗原构象、避免丧失亲和力。传统的突变策略有两种:一是定点突变,前提是抗体结构信息必须明确;二是随机突变,虽然可提高亲和力的多样性,但筛选工作量大。我们尝试将这二者相结合,选择13个关键氨基酸位点分别设计定点突变引物,同时又通过设计同位点的不突变对照、引物的随机组合分组等方法,增加这13个位点随机突变与组合的几率,最终结合噬菌体抗体展示技术,建立了库容为213的突变抗体库,经4轮亲和力淘选和噬菌体ELISA筛选,获得4株高亲和力的人源化单链抗体。基于上述构建和筛选,本研究得到2株特异序列来源的人源化单链抗体SGF1、SGF2,4株通用序列来源的人源化单链抗体P1h2、P1h3、P2h2、P2h5。通过同源建模的方法,模拟了e23sFv、SGF1、P1h2的结构并与HER2分子进行对接,预测人源化单链抗体的识别表位位于HER2胞外段第IV结构域,且SGF1主链碳原子构象比P1h2更接近e23sFv,而P1h2与HER2相互作用能比SGF1更强。经过原核蛋白表达纯化、包涵体复性,获得蛋白纯度大于90%,进行功能评价:（1）亲和力:通过表面等离子共振实验（SPR）观察人源化单链抗体对人重组HER2的亲和力,结果显示P1h2、P1h3、SGF1比e23sFv提高约10倍,P2h2、P2h5则与e23sFv相当;细胞ELISA观察它们对细胞表面天然表达HER2的亲和力,结果与SPR实验一致。（2）识别表位:荧光素标记人源化单链抗体,竞争性流式细胞术观察到,人源化单链抗体的HER2识别表位与e23sFv相同。（3）内化活性:激光共聚焦显微镜观察结果表明,荧光素标记的人源化单链抗体P1h2、P1h3、SGF1能够特异性结合并内化进入HER2阳性细胞;P2h2、P2h5、SGF2则不能内化。（4）免疫原性:ELISPOT及抗体偶联磁珠技术检测人源化单链抗体刺激细胞因子分泌的水平,结果表明,人源化单链抗体刺激PBMCs产生IFN-γ、TNF-α细胞因子的水平较鼠源单链抗体大幅下降,减少到鼠源单链抗体刺激水平的1/20。值得注意的是,特异序列来源的SGF1比通用序列来源的4株人源化单链抗体刺激细胞因子分泌的水平更高,提示其免疫原性相对较强。综上,我们从6株不同序列来源的人源化单链抗体中,优选出两株免疫原性低、亲和力高并且具有内化活性的单链抗体P1h2和P1h3,进行后续功能研究。针对第二个关键问题,我们探索了P1h2和P1h3用于两种靶向治疗策略的有效性:一是基于补体依赖的细胞毒作用（CDC）的间接肿瘤杀伤;二是基于本组前期建立成熟的免疫促凋亡策略的直接肿瘤杀伤。（1）CDC策略:在人源化单链抗体的C端融合表达人IgG1Fc,构建获得系列scFv-Fc融合蛋白,进行真核系统表达纯化。流式细胞术和体外CDC实验结果表明,P1h2-Fc、P1h3-Fc融合蛋白均能与HER2阳性肿瘤细胞特异性结合,间接杀伤肿瘤细胞。HER2高表达的乳腺癌细胞及中度表达的肺癌细胞中,P1h2-Fc、P1h3-Fc的杀伤作用均强于e23sFv-Fc。（2）免疫促凋亡策略:将人源化单链抗体构建替换入课题组前期建立的免疫促凋亡分子,获得scFv-Fdt-tBid,进行原核系统可溶表达纯化。流式细胞术和细胞杀伤实验观察到,P1h2-Fdt-tBid、P1h3-Fdt-tBid能够特异性结合HER2阳性肿瘤细胞,有效抑制细胞增殖;在HER2高表达的乳腺癌细胞、胃癌细胞、中度表达的肺癌细胞中,二者对肿瘤细胞的增殖抑制与e23sFv-Fdt-tBid相当。体内实验分别采用NOD-SCID鼠的三种不同荷瘤模型（乳腺癌原位瘤、胃癌原位瘤、肺癌皮下移植瘤）,明确观察到人源化改构免疫促凋亡分子的体内抗肿瘤活性。在乳腺癌和胃癌模型中,P1h2-Fdt-t Bid、P1h3-Fdt-tBid的肿瘤抑制作用强于e23sFv-Fdt-tBid;而肺癌模型中,二者的抗肿瘤作用与e23sFv-Fdt-tBid相当。综上所述,本研究通过优化CDR移植策略,针对抗HER2鼠源单链抗体e23sFv进行人源化改构,成功筛选获得免疫原性降低、亲和力提高并具有内化活性的两株人源化单链抗体P1h2、P1h3,并通过体内外实验验证其用于CDC策略和免疫促凋亡策略的有效性,为单链抗体为导向的融合蛋白的人源化改造、安全性评价提供了实验依据。