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第一章冠心病患者介入治疗前后循环内皮祖细胞与炎症因子的变化目的:研究冠心病患者PCI术前后外周血内皮祖细胞细胞形态、数量及细胞增殖、趋化能力的变化及血清中炎症因子CRP和TNF-α的变化。方法:选择冠心病患者64例和对照组30例,分别在PCI术前、术后即刻和术后4天用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白(HFN)包被培养板,加入生长因子VEGF165和bFGF的RPMI1640培基培养细胞,7d后贴壁细胞进行细胞分析和计数。用荧光显微镜鉴定FITC-UEAI和DiI-acLDL,双染色阳性细胞为正在分化的EPCs;用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34~+和KDR;并分析细胞形态和集落形成单位的数量;采用MTT比色法检测细胞的增殖活性,用趋化试验检测细胞的趋化能力;用免疫比浊法检测PCI术前后CRP的变化,同时用ELISA法检测PCI术前后TNF-a的表达。结果:1.冠心病患者外周血内皮祖细胞数量较对照组明显减少,PCI手术后EPCs细胞数目较术前明显增加,术后4天开始下降。2.冠心病患者的内皮祖细胞增殖活性和趋化活性较对照组明显降低,而PCI手术对其增殖和趋化活性没有明显的影响。3.冠心病患者的血清CRP及TNF-a均较对照组明显增高,在PCI术后CRP及TNF-a浓度均较术前明显增高,差异具有统计学差异,(P＜0.01);在术后第四天出现降低,与术前无明显区别,但是仍高于对照组。结论:1、冠心病患者内皮祖细胞数量及增殖、趋化能力较正常对照组明显减弱。2、冠心病患者PCI术后EPCs数量较PCI术前明显增加,PCI术后4天EPCs数量、增殖能力和PCI术前比较无差异,而EPCs的趋化能力较术前均增强。3、冠心病患者血清中炎症因子CRP及TNF-a水平明显高于对照人群;PCI术后CRP及TNF-a水平明显高于术前。术后4天CRP及TNF-a水平又开始下降。第二章CRP对健康成人外周血内皮祖细胞影响及机制研究第一节CRP对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响及非诺贝特的作用目的:从健康成人外周血中分离培养出内皮祖细胞,研究CRP对EPCs数量和功能的影响及加入非诺贝特后EPCs数量和功能的改变。方法:选择正常健康人,用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,用生长因子VEGF165和bFGF诱导细胞分化,观察细胞形态及细胞集落形成单位,并用荧光显微镜鉴定FITC-UEA-I和DiI-acLDL,双染色阳性细胞为正在分化的EPCs;用不同浓度的CRP和非诺贝特在不同时间段进行干预,观察EPCs的细胞集落形成单位数,用趋化试验检测细胞的趋化能力,用MTT法检测细胞的增殖活性,用硝酸还原酶法测定NO的含量。结果:1.从外周血中利用密度离心法分离出来的单个核细胞,通过生长因子VEGF165和bFGF的诱导分化,用荧光显微镜鉴定FITC-UEA-I和DiI-acLDL双染色阳性细胞为内皮祖细胞。2.随着CRP孵育EPCs作用时间及作用浓度的增加,EPCs的数量逐渐减少,细胞的增殖和趋化能力逐渐减弱。3.非诺贝特能拮抗CRP对EPCs的抑制作用,增加EPCs的细胞集落数量、细胞的增殖活性和趋化活性。4.CRP抑制EPCs分泌NO,加入非诺贝特后能显著增加NO的分泌。结论:1、CRP诱导EPCs数量下降,增殖、趋化能力明显减弱。2、CRP诱导下EPCs分泌的NO减少。3、非诺贝特能有效拮抗CRP对EPCs的抑制作用,起到保护内皮功能的作用。第二节CRP对内皮祖细胞损伤及非诺贝特保护作用的机制探讨目的:最近研究表明内皮祖细胞的衰老和端粒酶活性有关,因此,我们拟研究非诺贝特对CRP诱导的外周血EPCs衰老的影响及可能机制。方法:随机将前面分离培养的EPCs细胞分4组:①对照组,②CRP各浓度组(1μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml),③CRP(5μg/ml)+非诺贝特组(10μmol/L),④非诺贝特组((10μmol/L))。单个核细胞培养4天后,在12孔培养板加入不同浓度的CRP干预,或预先加入非诺贝特作用4惺?再加入5μg/mlCRP,继续培养7天后行SA-β-半乳糖苷酶染色,检测细胞衰老并计数每组衰老细胞数。当EPCs生长达适当密度时,按照TRIZOL操作程序提取EPCs总RNA,分组采用RT-PCR检测eNOS及hTERT mRNA表达。提取EPCs蛋白,用免疫印迹杂交法(Western Blot)半定量测定eNOS蛋白表达。结果:1.不同浓度的CRP与EPCs培养后,CRP促进EPCs的衰老,且CRP对EPCs衰老的影响随着CRP浓度的增加而增加,5μg/mlCRP组对EPCs衰老的影响最显著(p＜0.01、)。加入非诺贝特10μmol/L后能减少CRP诱导的衰老细胞数量(p＜0.01)。2.CRP作用EPCs后人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达随着CRP作用浓度的增加而下降,加入非诺贝特10μmol/L后可以显著逆转CRP诱导的hTERT mRNA表达下调。3.CRP能显著抑制eNOS mRNA及蛋白表达,但在加入非诺贝特10μmol/L后能显著上调eNOS蛋白表达。结论:1.CRP削弱内皮祖细胞的eNOS表达,引起hTERT的逆转录下降,从而使端粒酶活性下降,最后加速EPCs的衰老。从而影响内皮祖细胞的功能。2.非诺贝特活化hTERT,抑制CRP诱导的细胞衰老,可能与eNOS表达上调有关,从而起到保护内皮祖细胞的作用。