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猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度接触传染的呼吸道疾病。该病给集约化养殖业造成严重的经济损失。胸膜肺炎放线杆菌血清型众多,目前已分离鉴定了15种血清型的APP,其毒力因子非常复杂,型间交叉免疫保护率低,因而该病的诊断与防制相当困难。APP的Apx外毒素是其主要的毒力因子。已证实了ApxⅠ、ApxⅡ与ApxⅢ的溶血活性及对巨噬细胞与嗜中性粒细胞的毒性作用,且ApxⅢ被证实有诱导细胞凋亡的活性,而ApxⅣ仅具有微弱的溶血活性,其它作用尚不清楚。敏感、特异的诊断方法将有利于猪传染性胸膜肺炎的控制。目前我国普遍应用的诊断方法为间接血凝试验(IHA),该方法具有血清型特异性,不适合于对APP的普查。最近发现的ApxⅣ存在于所有血清型APP中,且具有种特异性,适合用于建立可以普查APP的诊断方法。ApxⅣ的另一特点为体内诱导的毒素,而目前市面上用体外培养方法制备的疫苗中均不存在ApxⅣ,因此基于ApxⅣ的诊断方法可以鉴别诊断自然感染猪与疫苗免疫猪。为了建立有效的诊断方法及对APP外毒素作用机制进行深入研究提供特异性单克隆抗体,我们开展了以下工作: 1 apxⅣ基因的克隆与及其在大肠杆菌中的表达 依据APP血清1型的apxⅣ基因序列(GeneBank登陆号:AF021919)合成特异性引物,分三段从APP 0306SYML中分别扩增了apxⅣ基因的5′-端3.6Kb、5′-端2.5Kb和3′-端3.0Kb片断,分别克隆到pMD-18T,获得重组质粒pT apxⅣ3.6、pT apxⅣA5与pT apxⅣA3,并进行了测序:将apxⅣA5与apxⅣA3分别克隆到质粒pET-28b的T7启动子下游,构建了重组原核表达质粒pET apxⅣA5与pET apxⅣA3,分别用于表达ApxⅣ N-端与C-端蛋白,转化E. coli BL21(DE3)后经IPTG诱导获得高效表达,经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白的分子量分别为90kDa与115kDa,分别命名为rApxⅣAN与rApxⅣAC,表达产物主要以包涵体形式存在,Western blot证实表达产物具有良好的反应原性。 2 鉴别诊断方法的建立 用大肠杆菌表达的重组蛋白rApxⅣAN建立了ApxⅣ-ELISA方法。用方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度为2.97μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:80。通过检测53份猪传染性胸膜肺炎阴性血清,确定该方法的临界值为0.336。该方法的重复性良好。用该方法从副猪嗜血杆菌(HPS)、产毒素巴氏杆菌(DNT~+Pm)、大肠杆菌(E. coli)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪衣原体(CP)的标准阳性血清及APP全菌灭活苗与类毒素菌苗免疫猪血清中检测不到ApxⅣ抗体,而从APP活菌感染的动物血清中能检测到ApxⅣ抗体,说明该方法不仅具有种特异性,只能用于APP感染的检测,还可以鉴别诊断全菌灭活疫苗或亚