溴氰菊酯和甲氰菊酯酶联免疫吸附测定方法研究

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为探索小分子免疫化学分析的基本规律并应用于农药残留分析实践,本论文选择拟除虫菊酯类杀虫剂溴氰菊酯和甲氰菊酯为研究对象,分别建立了溴氰菊酯和甲氰菊酯间接竞争酶联免疫吸附测定方法。利用溴氰菊酸和α-氰基-3-苯氧基苄醇为原料合成了溴氰菊酯的半抗原1-羧基-(3’-苯氧基苯基)甲基-3-(2’,2’-二溴乙烯基)-2,2-二甲基环丙基羰酸酯(Med)和N-2-(羧基丙基)氨甲酰基-(3’-苯氧基苯基)甲基-3-(2’,2’-二溴乙烯基)-2,2-二甲基环丙基羧酸酯(Di);通过碳二亚胺法将半抗原Di与牛血清蛋白(BSA)偶联作为免疫抗原,通过混合酸酐法将Di、Med分别与卵清蛋白(OVA)偶联作为包被抗原,将免疫抗原免疫新西兰大白兔后获得多克隆抗体,冻干粉效价为2.5×105。通过同源异源分析,发现异源分析的灵敏度较高,并分别对甲醇含量、离子强度、pH值等影响因素进行了研究,确定30%甲醇、0.4 mol/L Na+和pH7.5的PBS作为该拟除虫菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法的最佳工作条件,测得对溴氰菊酯的IC50为0.55±0.05 mg/L,最低检测限(LDL,IC10)为3.76±0.35μg/L(n=4)。就溴氰菊酯而言,除与其代谢物和氯氰菊酯有一定交叉反应外,对下列拟除虫菊酯如氯菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯等没有明显的交叉反应;分别在自来水及河水、土壤、甘蓝、苹果样品中添加0.05~5.0 mg/kg溴氰菊酯用建立的间接竞争ELISA方法检测,添加回收率分别为92.9%~106.8%,85.7%~101.7%,75.6%~97.8%,82.6%~106.2,82.8%~108.6,变异系数为2.0%~3.7%,1.8%~3.7%,2.4%~7.3%,2.2%~6.2%,4.6%~8.3%.以甲氰菊酸和α-氰基-3-苯氧基苄醇为原料,合成了甲氰菊酯的半抗原1-羧基-(3-苯氧基苯基)甲基-2’,2’,3’,3’-四甲基环丙基羧酸酯(Ⅲ)和N-2-(羧基丙基)氨甲酰基-(3-苯氧基苯基)甲基-2’,2’,3’,3’-四甲基环丙基羧酸酯(Ⅳ)。通过碳二亚胺法将半抗原Ⅳ与牛血清蛋白(BSA)偶联作为免疫抗原,通过混合酸酐法将Ⅲ和Ⅳ分别与卵清蛋白(OVA)偶联作为包被抗原,将免疫抗原免疫新西兰大百兔后获得多克隆抗体,冻干粉效价为2.56×105。通过同源异源分析,发现异源分析的灵敏度较高,并分别对甲醇含量、离子强度、pH值等影响因素进行了研究,确定30%甲醇、0.4 mol/L Na+和pH7.5的PBS作为其间接竞争酶联免疫吸附分析方法的最佳工作条件,测得对甲氰菊酯的IC50为0.34±0.09 mg/L,检测限为9.93±0.65μg/L。经特异性测定发现,除与其代谢物有一定交叉反应外,对氯菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯等均无明显的交叉反应。在自来水中添加0.05~1.0 mg/L甲氰菊酯,回收率91.9%~101.2%,变异系数为2.9~6.8%。达到了拟除虫菊酯类农药残留的分析要求。
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