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目的:研究石家庄地区夏秋季优势蝇种肥须亚麻蝇(Parasarcophaga crassipalpi)幼虫生长发育规律,探讨温度对幼虫头咽骨及体内非特异性酯酶(non-specific esterase, NSE)的影响,积累石家庄地区尸食性蝇类的发育生物学资料,为刑事调查推断死后间隔时间(postmortem interval,PMI)提供科学依据。方法:1头咽骨形态学观察及测定:在河北医科大学校园内诱捕肥须亚麻蝇,带回实验室饲养至第三代作为母代开始实验。设定生化培养箱的温度依次为16℃、20℃、24℃、28℃、32℃,保持湿度和光周期恒定。在所有的温度条件下,湿度、光周期和食物种类及数量不变。从幼虫孵出开始,每隔12h留取一次标本,每组每次留取10头幼虫,直至化蛹。幼虫用80℃热水烫死,然后放入浓度为70%的甘油酒精中保存。从保存液中取出幼虫标本后,吸干表面液体,放在培养皿上,用大头针在幼虫腹部一侧扎几个小孔,放入10%的KOH溶液中消化内部组织,24h后将幼虫从KOH溶液中取出,放在培养皿上用镊子轻轻按压幼虫,直至将体内已消化的组织排出。幼虫在清水中洗净数遍后,在体视显微镜下分离出幼虫的头节,仅用于形态观察的标本依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精中逐级脱水,最后用二甲苯透明,镜下整姿后滴加拿大树胶封片,置于阴凉处风干。光学显微镜下观察、拍照。用于进行形态学指标测定的标本须将头咽骨在体视显微镜下进行对称分离后再依以上过程制成封片标本,利用计算机图像分析系统对头咽骨的口钩及咽骨的面积、骨化面积和平均光密度等多项指标进行测定。2幼虫体内非特异性酯酶的测定:将单只蝇幼虫用磷酸盐缓冲液(PBS,PH6.8)洗涤三遍,用滤纸吸干后,分装在Eppendorf管中,置于-20℃冰箱1h。将单只幼虫取出后,加入100μl PBS(PH6.8)冰浴匀浆,充分匀浆后再加入400μl PBS(PH6.8),12000r/ min 4℃离心10min,取上清液作为酶源。将100μl酶液加至96孔微量滴定板孔中,每孔再加100μlβ-乙酸萘酯溶液(β-naphthyl acetate,β-NA),在25℃条件下反应10min,之后每孔再加100μl坚固蓝B盐溶液(fast blue B salt),室温反应5min,立即在450nm波长下读取OD值。以上所有数据结果由SPSS 11.5软件处理得出,相同温度下各组指标的变化进行单因素方差分析,应用Excel程序作图。结果:1在恒定温度下,随着幼虫的发育,肥须亚麻蝇幼虫头咽骨的颜色由淡黄色逐渐变为棕褐色发展至最后的黑褐色,几丁质化程度不断加强,骨化的范围不断增大,并在三龄期发现点状的附口骨。2幼虫口钩的面积随时间的延长呈阶段性增加,龄期更替时变化显著,尤以二、三龄更替时最显著。面积达到最大值后,随时间的延长基本维持不变。幼虫口钩的平均光密度和骨化面积的变化趋势和面积指标相似,但一、二龄期内变化较口钩面积显著。口钩骨化度在每个龄期内呈现增长趋势,进入新龄期后数值下降,开始新的增长过程。三龄初期口钩骨化度几乎达到100%,之后随时间延长无明显变化。口钩腹基角的变化趋势与前三项指标变化趋势完全相反,随时间的延长呈阶段性下降,进入三龄后几乎立即达到最小角度,之后无明显改变。3幼虫咽骨面积的变化趋势与口钩面积的变化趋势相同。但随时间的延长16℃至32℃各组幼虫咽骨的平均光密度和骨化面积呈现持续性增加的趋势,并一直保持到三龄结束,是推测PMI的理想指标。在不同温度下,两者的发育速率与温度成正比,随温度升高而加快,龄期越短平均光密度和骨化面积达到最大值的时间就越短。咽骨骨化度的变化趋势与口钩骨化度变化相似,但进入三龄后咽骨骨化度曲线无平台期,而是一直保持递增的趋势至三龄结束,三龄末咽骨骨化度的最大值要比此时对应口钩骨化度的最大值小。4在供试的五种恒定温度下,各组幼虫非特异性酯酶活性(OD值)随时间的延长呈阶段性增加。一龄到二龄的变化趋势较平缓,二龄到三龄的曲线变化明显。三龄初期OD值仍保持上升趋势,三龄中后期OD值有所下降,但仍明显高于二龄期幼虫OD的最大值。结论:1肥须亚麻蝇幼虫的发育随温度的升高而加快。在恒定温度下,随时间延长幼虫头咽骨颜色由淡黄色逐渐变为棕褐色至最后的黑褐色,几丁质化程度不断加强,骨化的范围不断增大,并在三龄期出现点状的附口骨。2幼虫口钩的面积、平均光密度和骨化面积随时间的延长而增加,龄期更替时变化显著,但进入三龄达到最大值后变化不明显。口钩骨化度在每个龄期内随时间的延长而增加,进入新的龄期数值立即下降开始新的增长过程。口钩腹基角随时间的延长呈阶段性下降,进入三龄后几乎立即达到最小角度,随时间延长无明显改变。3幼虫咽骨面积的变化趋势与口钩面积的变化趋势相同。但随时间的延长咽骨骨化面积和平均光密度呈现持续性增加的趋势,并一直保持到三龄结束,是推测PMI的理想指标。咽骨骨化度的变化趋势与口钩骨化度变化相似,但进入三龄后该值依然保持递增的趋势,且最大值比对应时间点的口钩骨化度的最大值小。4幼虫非特异性酯酶活性(OD值)在不同龄期间呈阶段性增长,一龄到二龄的变化趋势较平缓,二龄到三龄的曲线变化明显。三龄初期OD值仍保持上升趋势,三龄中后期OD值有所下降,但仍明显高于二龄期幼虫OD的最大值。