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小麦(Triticum aestivum L.)白粉病是严重危害小麦生产的病害之一,它是由白粉菌(Blumeria graminis(DC.)E.O. Speer f.sp. tritici Em. Marchal,Bgt)引起的世界性病害。控制白粉菌的有效途径是培育抗性品种。小麦“兰考90(6)”系列品系是我省培育的抗白粉病种质,对其抗白粉病相关基因进行克隆研究不仅有利于阐明其抗病机制,而且对抗病育种有重大意义。本研究具体研究内容及结果如下:
1.Tα-JA2基因的克隆和鉴定。用基因芯片技术结合分池法(bulked segregating analysis;BSA)对参与小麦“兰考90(6)”抗白粉病反应或与抗病基因连锁的EST进行了分析。从“中国春”中克隆了一个与Tα-JA1高度相似的新的小麦茉莉酮酸酯诱导蛋白基因(GenBank登录号:EU035635),命名为Tα-JA2。Tα-JA2和Tα-JA1的cDNA序列有99%相同,编码304个氨基酸组成的多肽。Tα-JA2具有植物病原应答诱导蛋白-dirigent-类蛋白的典型保守功能域和jacalin-类植物血球凝集素的典型保守功能域。Tα-JA2主要在叶片和茎中表达,在根和幼穗中几乎不表达;在幼叶、倒二叶和旗叶中的表达水平依次增强;在“中国春”和一个二粒小麦(Triticum dicoccoides)品系幼叶中的表达受白粉菌的诱导而增强;在“兰考90(6)21-12”叶片中的表达保持稳定而较高的水平。根据氨基酸序列的相似性建立了Tα-JA2类似蛋白的树形图,提供了植物中此类基因的进化信息。
2.TαAetPR5基因的克隆和鉴定。在“兰考90(6)21-12”中克隆了一个与粗山羊草(Aegilops tauschii)csAtPR5类似的基因,命名为TαAetPR5(GenBank登录号:EU082094)。TαAetPR5编码一个657个氨基酸组成多肽,与csAtPR5有88%的序列相同,是可溶性球状蛋白,可能位于小麦细胞核中。连锁分析表明,该基因与PmLK906连锁,遗传距离约为7.6cM。根据csAtPR5类似基因设计的一对特异性引物可作为PmLK906的STS分子标记。TαAetPR5在“兰考90(6)21-12”幼苗叶片未接种病原菌时就有一定量的表达,接种12小时后转录有所下降,而接种后12~72小时,转录水平持续增强。将该基因连入载体pCAMBIA-1301-220U,通过农杆菌茎尖法和花粉管通道法进行遗传转化,转基因材料的检测正在进行。
3.TαXα基因的克隆和鉴定。在小麦高分子量麦谷蛋白基因位点附近有一个编码LRR-类受体蛋白激酶的基因位点(暂标记为TαXα),编码蛋白与水稻(Oryza sativa)抗病蛋白Xα21类似。通过反转录PCR途径,从二粒小麦的TαXα同源位点分离了1个cDNA克隆,我们分离的cDNA克隆编码1026个氨基酸组成的多肽,是目前最接近编码1028个氨基酸的推测小麦属TαXα全长基因,可能具有该位点基因的完整功能。利用半定量反转录PCR(Semi-QRT-PCR)技术,研究了TαXα基因的表达,结果证明TαXα在根、茎、叶和穗中均有表达,在旗叶中的表达量最高。TαXα在幼苗叶中的表达受白粉病菌的诱导而显著增强,诱导后24小时达到峰值,随后转录水平下降。以载体pCAMBIA-1301-220U为基础构建了TαXα基因的表达载体。