手足口病是是一种常见的病毒性的传染病,多发生于5岁以下儿童,症状主要表现为手、足、口腔等部位出现红色疱疹或溃疡。手足口病主要是由20多种肠道病毒引起的,其中以柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CoxA16)和肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)最为常见[1]。由于EV71感染引起的病例可引起脑膜炎、心肌炎、肺水肿等多种中枢神经系统并发症,导致的死亡率较高,是以备受关注[2]。EV71属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员,为单股正链RNA病毒[3]。EV71病毒颗粒主要有四种衣壳蛋白组成,即VP1,VP2,VP3和VP4。这四种衣壳蛋白共同构成EV71病毒的原聚体,VP1、VP2和VP3暴露在病毒的表面,而VP4包埋在病毒的内侧,其中主要抗原决定簇集中于VP1上[4]。VP1蛋白EV71病毒的主要抗原决定簇,可用于EV71分子的基因分型、流行病学监测和亚单位疫苗的开发。目前为止对于EV71还没有有效的治疗药物,所以研制针对EV71的疫苗就显得极为重要。目前有关EV71的疫苗主要有:灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒和转基因植物疫苗等[5],这些疫苗除了灭活疫苗被批准进入临床实验以外其他疫苗仍然实验室研究阶段。手足口病主要流行于亚太地区的发展中国家,因此,理想的EV71疫苗应该具有价格低廉,安全,方便施用,并且易于被患者家庭接受等优点。由于口服免疫具有较高的安全性并且易于操作,对于防治发展中国家儿童肠道病原体感染口服免疫是一种安全实用的方法。EV71主要通过粘膜部位侵入人体,粘膜免疫系统对于防止病毒感染具有重要作用。研究报道表明,口服免疫EV71免疫制剂有效地预防EV71的感染[6]。酿酒酵母是一种安全的食品级微生物,无感染性和致病性。研究报道证明,在酿酒酵母中表达外源性抗原基因能够保护宿主抵抗病原微生物感染。目前,酿酒酵母已经被运用于多种口服疫苗和药物。许多研究已经表明,EV71的VP1蛋白可以作为口服疫苗的抗原用于制备EV71 口服疫苗,小鼠口服免疫这种重组重组蛋白能够在其体内诱导体液免疫和细胞免疫应答[6]。所以,在酿酒酵母表面展示EV71抗原蛋白用于制备针对EV71的口服疫苗在理论上是可行的。本研究由2部分组成:第一部分:EV71 VP1蛋白的酵母表面展示及鉴定本研究选取EV71的C2亚型B6株作为研究对象,参照GenBank中肠道病毒71型C2株VP1基因序列设计引物,PCR扩增得到预期目的产物。双酶切目的基因插入酿酒酵母表面展示载体pYD1,转化大肠杆菌,提取重组质粒经鉴定后转化酿酒酵母感受态细胞EBY100,半乳糖诱导重组酵母细胞表达目的蛋白。收集不同时间点诱导的酵母细胞通过蛋白免疫印迹(Western Blot)、共聚焦荧光及流式细胞仪检测外源蛋白的表达。结果显示VP1蛋白成功表达于酵母细胞表面并且能够于VP1抗体结合,流式分析测得重组酵母菌最佳诱导时间为24-36h。第二部分:表面展示VP1蛋白的重组酵母免疫原性研究以表面展示VP1蛋白的酵母活细胞通过灌胃途径免疫六周龄BALB/c小鼠,研究其免疫原性。样品组小鼠灌胃500ul重组酵母EBY100/pYD 1-VP 1(109cells/ml)免疫小鼠,阴性对照组则免疫相同剂量的空载转化酵母EBY100/pYD1,以腹腔注射灭活EV71全病毒为阳性对照组。初次免疫后分别在第2周和第4周进行增强免疫。每次免疫前对小鼠进行眼眶采血,末次免疫2周后摘眼球取血并分离小鼠脾淋巴细胞。通过免疫后的小鼠血清的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果表明,初次免疫EBY100/pYD1-VP1和灭活EV71均能诱导小鼠体内高水平的IgG和IgM表达。体外中和实验显示:口服重组酵母免疫小鼠血清的中和滴度可达1:32左右。分离小鼠脾淋巴细胞用ELISA与ELISpot方法分别测定免疫小鼠淋巴细胞分泌的TNF-α及INF-y水平,发现样品组和阳性对照组小鼠的TNF-α浓度、INF-γ分泌细胞明显高于阴性对照组。这些结果表明,不管是口服重组酵母还是和腹腔注射灭活EV71全病毒都可以引起免疫小鼠体内Th1型细胞免疫应答。最后,母婴传递实验也表明,口服重组酵母的母鼠能够在一定程度上的保护乳鼠免于致死剂量的EV71病毒感染。本研究以表面展示VP1蛋白的酿酒酵母为载体,通过灌胃途径免疫小鼠研究其免疫原性,初步阐明了表面展示VP1蛋白的活酵母可以诱导免疫小鼠体内产生特异性免疫应答,为下一步研究EV71 口服免疫制剂奠定基础。