论文部分内容阅读
Mx蛋白是在IFN诱导下产生的抗病毒蛋白质,禽类的Mx蛋白具有抵抗禽流感病毒及水疱性口炎病毒(VSV)的功能,由于禽类是禽流感的自然宿主,因此对禽类Mx蛋白基因进行研究具有重要意义。本研究以中国地方品种——北京油鸡(BeiJing-You,BJY)和引进品种——白来航(White Loghorn,WLH)作为实验动物,采用SSCP,RFLP分析方法研究GED区的变异,获得Mx蛋白基因全长并对基因组结构进行分析;同时进行了诱导条件下两个不同品种Mx蛋白基因表达差异的研究及原核表达载体的优化及表达研究。所得结果如下:GED区是Mx蛋白执行抗病毒的功能区域,应用PCR-SSCP和PCR-RFLP的方法对GED区进行研究,通过北京油鸡(n=150)和白来航(n=150)两个品种Mx基因GED区分析,发现在631位点氨基酸对应的2216碱基突变的基因型及基因频率在两个品种中存在显著差异。其中,白来航等位基因(抗病基因)A的频率0.8471显著高于北京油鸡(0.1613);相反,北京油鸡等位基因B(易感基因)的频率(0.8387)显著高于白来航(0.1529)。X2独立性检验表明在两个不同的品种间,该位点的基因型分布存在极显著的差异,白来航AA基因型的频率显著高于北京油鸡。两个群体在P2-SSCP位点上基因型和基因频率都处于Hardy-Weinberg平衡状态。由于对2216突变位点进行PCR-RFLP研究时无合适的限制性核酸内切酶,为方便进行突变位点的检测,实验中设计错配碱基产生合适的酶切位点,建立了一套快速检测Mx基因2216突变位点的检测体系,结果稳定可靠。通过polyI:C诱导,获得了鸡Mx蛋白基因全长序列,GenBank提交序列号EU348752。测序结果预测的氨基酸显示631位是Asn,可以作为转基因的外源DNA序列进行转基因研究。利用北京油鸡和白来航血液基因组DNA分别获得了Mx基因的14个外显子,与利用cDNA序列预测结果一致,其中编码区包含13个外显子,exon1为非编码的。14个外显子大小分别为:48bp,329bp,193bp,138bp, 155bp,139bp,199bp,79bp,123bp,142bp,159bp,77bp,243bp,463bp。对北京油鸡和白来航鸡胚成纤维细胞进行诱导表达的研究时,发现不同浓度诱导剂(polyI:C)诱导时,白来航和北京油鸡Mx蛋白基因表达在两个不同的品种间存在明显差异(半定量),利用实时定量PCR(real-time PCR)对白来航Mx蛋白基因表达情况进行研究,获得的结果与半定量结果相同,具体机制需要研究探讨。通过对获得的Mx蛋白基因在大肠杆菌中表达时稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构的分析,构建了四种重组表达菌。经优化稀有密码子和翻译起始区的二级结构,在pETRTMx,pGEXRTMx重组表达菌中获得了Mx蛋白基因的表达( 75KDa)。实验中首次获得了表达鸡Mx蛋白基因全编码区ORF的重组菌。实验结果也说明选择合适的表达载体和宿主菌对外源基因的表达和获得较高的表达量在原核表达选择设计中很重要。