根据国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer, IARC)在2009公布的人类确证致癌物名单中,镍化合物是人类致癌物。流行病学研究已证实,镍接触与肺癌发病率有显著的相关性。目前,针对镍化合物与肿瘤的研究已有不少报道,但镍与肺癌的直接作用及其相关机制研究相对较少。因此,进一步开展镍对肺癌发生发展的影响研究具有十分重要的意义；探讨镍对肺癌作用的相关机制,可以为镍职业暴露和接触人群的预防和治疗提供新的思路。本课题通过镍直接作用于肺癌细胞,研究肺癌细胞发展中的侵袭能力及其相关机制,口前尚未见报道。Toll样受体4(TLR4)是近年来肿瘤相关研究的热点,其促进肿瘤发生、侵袭、转移、复发、耐药、免疫逃逸的分子机制,受到国内外的广泛关注。最近的研究发现,TLR4的mRNA和蛋白表达水平在肺癌组织中都增高,TLR4的表达水平与肺癌的恶性程度呈正相关。研究认为,镍可通过直接激活TLR4而触发炎症反应,炎症反应与肿瘤的发生发展密切相关。但是,镍是否可促进肺癌发展中的侵袭和生长等能力,其相关的机制如何?还不甚清楚。因此,本课题以水溶性氯化镍(NiCl2)为研究因素,采用人非小细胞肺癌的细胞株A549和H1299作为研究对象,研究二价镍(Ni2+)对肺癌细胞发展中侵袭能力的影响及其相关机制。用体外侵袭实验检测侵袭性细胞的数量,观察镍对肺癌细胞的生长和侵袭能力的影响；用ELISA方法分析经镍刺激后的A549和H1299细胞分泌白细胞介素8(IL-8)和肿瘤生长因子β(TGF-β)浓度的变化；用Western Blot方法分析经镍刺激48h后,A549和H1299细胞内基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、髓样分化因子88(MyD88)、Toll样受体相关干扰素活化子(TRIF)表达的变化,以及MyD88信号通路下游区的白介素1受体相关激酶4(IRAK4)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、核因子κB (NF-κB)和活化蛋白1(AP-1)的表达情况,探讨镍对肺癌细胞中TLR4信号通路的影响；用siRNA干扰的方法下调TLR4和MyD88在A549和H1299细胞中的蛋白表达水平,检测其侵袭能力；将A549和H1299细胞分别与p38MAPK特异性抑制剂SB203580、NF-κB抑制剂PDTC和JNK抑制剂1孵育,经镍刺激后检测其侵袭能力,研究p38MAPK通路和NF-κB通路在镍增强人肺癌细胞侵袭能力所起的作用。本研究共分以下四部分：第一部分镍对人肺癌细胞生长和侵袭能力的影响本部分主要以人肺癌细胞的细胞株A549和H1299做为模型,研究镍对肺癌细胞侵袭能力的影响。通过Transwell实验,检测和比较不同浓度的镍刺激前后二种细胞穿过人工基质膜的数量,以此观察不同浓度镍刺激前后肺癌细胞的侵袭能力的影响。利用ELISA方法,检测并比较不同浓度的镍刺激前后,A549和H1299所分泌的IL-8和TGF-β的水平。癌细胞表达的基质金属蛋白酶的水平对其侵袭能力有重要作用,我们采用Western Blot方法,检测镍刺激前后人,A549和H1299所表达的MMP-2和MMP-9蛋白水平,并通过荧光定量PCR实验对这两种基质金属蛋白酶的mRNA水平进行验证。通过以上实验,研究镍对肺癌细胞侵袭能力的重要影响。镍对人肺癌细胞侵袭能力影响的研究结果显示：在Transwell实验中,A549和H1299在受不同浓度镍刺激后,穿过人工基质膜的细胞数量显著增加；癌细胞分泌IL-8和TGF-β的水平显著升高,同时癌细胞所表达的MMP-2和MMP-9水平显著升高,mRNA水平也证明了相似的结果。镍对人肺癌细胞增殖能力影响的研究结果显示：在MTT实验中,镍在2mM浓度连续作用48h对两个细胞株增殖能力的影响最大。该部分结果表明：镍刺激A549和H1299后,导致肺癌细胞的侵袭能力增加,同时肺癌细胞分泌IL-8和TGF-β的水平以及表达MMP-2和MMP-9的水平显著升高。这些细胞因子以及蛋白水平的升高可帮助癌细胞消化人工基质膜,从而促进肺癌细胞的侵袭。提示镍可增强人肺癌细胞分泌IL-8、TGF-β的水平以及表达MMP-2和MMP-9的水平,增强肺癌细胞的侵袭能力。第二部分镍在人肺癌细胞中对TLR4信号通路的影响本部分研究中,我们选择TLR4信号通路为研究对象,检测镍对肺癌细胞中TLR4信号通路及其下游的影响。我们首先通过流式细胞仪,检测镍对A549和H1299细胞表面TLR4表达的影响,并利用荧光定量PCR检测TLR4的mRNA水平进一步验证。TLR4下游有TRIF和MyD88两个重要分子介导的两条不同的信号转导通路,我们通过Western Blot和荧光定量PCR的方法,分别检测镍刺激前后,二种人肺癌细胞所表达的TRIF和MyD88的蛋白水平和mRNA水平。在得到结果后,再检测MyD88所介导的信号转导通路下游的重要分子IRAK4、 TRAF6、NF-κB和AP-1的蛋白水平和mRNA水平,以进一步证明镍对人肺癌细胞中TLR4受体及其下游MyD88信号转导通路的影响。镍在人肺癌细胞中对TLR4信号通路影响的研究结果显示：在镍刺激后,A549和H1299细胞表面表达的TLR4水平并没有显著变化。TLR4的mRNA水平也显示,镍不影响人肺癌细胞TLR4的表达。对TRIF和MyD88蛋白水平和mRNA水平的检测结果显示,镍可以显著增加人肺癌细胞中MyD88的表达水平,而并不影响TRIF的表达。进一步对MyD88下游重要分子的蛋白和mRNA水平的分析结果显示,镍可显著增加MyD88下游IRAK4、TRAF6、NF-κB和AP-1的表达。该部分结果表明：在肺癌细胞株A549和H1299中,镍不影响细胞中TLR4的表达,但可显著增加TLR4下游MyD88的表达,同时镍不影响TRIF的表达,说明镍在人肺癌细胞中,可能特异激活TLR4信号通路下游MyD88所介导的信号转导,而不影响TRIF介导的信号转导。进一步对MyD88下游重要分子的蛋白和mRNA水平检测也显示,镍可以显著增加MyD88下游IRAK4、TRAF6、NF-κB和AP-1的表达,验证了我们的推测,镍可增强肺癌细胞中TLR4信号通路下游MyD88所介导的信号转导。第三部分镍通过影响TLR4/MyD88信号通路增强人肺癌细胞侵袭能力在这部分工作中,我们主要研究镍激活TLR4信号通路以及其下游MyD88所介导的信号转导与镍增强肺癌细胞侵袭能力之间的关系。我们首先建立小RNA干扰系统,通过在人肺癌细胞中转染可以干扰TLR4和MyD88分子表达的小RNA,将细胞中TLR4和MyD88的表达水平降低。通过荧光定量PCR检测TLR4下游分子mRNA表达水平,进一步验证小RNA干扰的效果。接着,我们在TLR4和MyD88表达水平非常低的肺癌细胞中用镍刺激,通过Transwell实验检测这些几乎不表达TLR4和MyD88的肿癌细胞,在受镍刺激后细胞侵袭能力是否有变化；通过MTT实验检测干扰TLR4和MyD88后的肺癌细胞,在受镍刺激后细胞增殖能力是否有变化。对镍通过影响TLR4/MyD88信号通路增强人肺癌细胞侵袭能力的研究结果显示：在A549和H1299中,我们建立的小RNA干扰系统可以成功实现对TLR4和MyD88分子表达的干扰。Western Blot和荧光定量PCR实验结果显示,在转染小RNA干扰的人肺癌细胞中,TLR4和MyD88几乎没有表达。进而,在用这些几乎不表达TLR4和MyD88的癌细胞进行Transwell实验,结果显示,在镍刺激之后癌细胞的侵袭能力显著降低。而MTT的结果显示,干扰了TLR4和MyD88后,人肺癌细胞A549和H1299对镍的敏感性降低。该部分结果表明：镍增强人肺癌细胞的侵袭能力是通过TLR4/MyD88信号通路介导的。在几乎不表达TLR4或MyD88的肺癌细胞中,镍没有增强细胞侵袭能力,也不能显著影响细胞的增殖能力,且此时肺癌细胞的侵袭能力下降。这表明,镍增强肺癌细胞侵袭能力是依赖TLR4/MyD88的,即TLR4/MyD88对肺癌细胞的侵袭能力也是十分重要的。第四部分p38MAPK通路和NF-κB通路对镍增强人肺癌细胞的侵袭能力是必要的前三部分研究证明了镍可增强肺癌细胞的侵袭能力,且这种增强作用是依赖于TLR4/MyD88信号通路。本部分通过对MyD88下游信号通路几种重要分子的具体研究,分析在信肺癌细胞中,镍的作用对MyD88下游信号通路的特异选择性。MyD88下游主要有NF-κB和MAPK两个重要通路,我们用这两个通路的特异性抑制剂处理人肺癌细胞A549和H1299,随后在Transwell实验中,检测镍对肺癌细胞的侵袭能力。通过p38MAPK通路和NF-κB通路对镍增强肺癌细胞的侵袭能力必要性的研究结果显示：p38MAPK和NF-κB特异性抑制剂处理过的A549和H1299,在受到镍刺激后,并不显著增加细胞侵袭能力,而受到JNK抑制剂处理过的人肺癌细胞,在受到镍刺激仍表现出显著增加的细胞侵袭能力。该部分结果进一步表明：镍增加人肺癌细胞的侵袭能力是通过TLR4/MyD88信号通路；而在MyD88下游,镍的这种作用是依赖于p38MAPK和NF-κB通路。在抑制p38MAPK和NF-κB活性的肺癌细胞中,镍不能增强其侵袭能力,而抑制JNK的活性,在镍的刺激中并没有显著影响作用。