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目的:利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,观察比较腺病毒与慢病毒载体分别介导EGFP对体外培养的兔角膜基质细胞的转染效率及对细胞的安全性,探讨较优一种病毒载体作为角膜基因治疗载体的可行性,为后继采用该病毒载体介导目的基因转染治疗屈光术后角膜haze生成奠定基础。方法:离体兔角膜基质细胞的原代、传代培养及鉴定;实验分为转染组和对照组,转染组用慢病毒载体携带增强型绿色荧光蛋白报告基因(LV-EGFP)与腺病毒载体携带增强型绿色荧光蛋白基因(AV- EGFP)分别感染离体兔角膜基质细胞(RCSCs),对照组则加入空白培养液,在不同感染复数(MOI)及感染后不同的时间段在倒置荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,流式细胞技术(FCM)检测转染效率;RT-PCR检测转染组和对照组EGFP的mRNA表达情况;光镜及电镜技术观察转染组细胞形态及超微结构的变化;MTT比色法检测两种病毒载体对角膜基质细胞活性的影响。结果: 1. AV-EGFP感染基质细胞后从24-48小时开始就可见明显的绿色荧光,起始时间早于LV-EGFP转染组。随着MOI值增大,两转染组转染效率均增高。转染后第3天,慢病毒转染组在MOI=1000时转染效率可达61%,而腺病毒转染组转染效率为40%。在同一MOI值下,慢病毒较腺病毒载体转染效率更高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.RT-PCR检测两转染组均有EGFP的mRNA表达,而对照组无表达。AV-EGFP与LV-EGFP转染组相比,AV-EGFP转染组的EGFP mRNA表达偏低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.电镜结果显示AV-EGFP转染组在MOI=104时及LV-EGFP转染组在MOI=1000时转染组细胞出现细胞凋亡,而慢病毒在MOI=500时,转染组细胞超微结构未见明显异常。4.慢病毒载体在MOI≤500时,腺病毒载体在MOI≤1000时,两种病毒对细胞活性的影响,转染组分别与对照组比较,差异无统计学意义。慢病毒载体在MOI≥1000,腺病毒载体在MOI≥104转染组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),病毒载体抑制细胞的活性,细胞存活率下降。且当MOI=104时,慢病毒载体转染组与腺病毒载体转染组比较差异无统计学意义(P>0.05),两病毒载体对细胞活性影响无差别,均导致细胞活性下降。结论:1.腺病毒与慢病毒载体均可有效转染离体兔角膜基质细胞,以慢病毒载体转染效率更高。2.腺病毒最适感染复数为1000,其转染效率在第三天可达40%,慢病毒最适感染复数为500,其转染效率在第三天可达50%。3.腺病毒载体用于离体兔角膜基质细胞转染的安全浓度范围应在MOI≤1000,慢病毒载体用于离体兔角膜基质细胞转染的安全浓度范围应在MOI≤500。