布鲁氏菌病(blucellosis)是由布鲁氏菌引起的一种严重的人兽共患病。患病家畜是本病的主要传染源,对易感家畜用布鲁氏菌病活疫苗进行免疫是布鲁氏菌病防控的主要措施。但传统的注射免疫存在对孕畜不安全、抗体持续时间较长影响鉴别诊断等缺点。布鲁氏菌口服活疫苗(S2株)出现后,克服了注射免疫造成的对孕畜不安全、抗体持续时间较长影响鉴别诊断的缺点。但口服免疫又出现了免疫时疫苗容易流失的问题,对操作人员自身安全造成一定威胁,还会因流失而导致免疫剂量不足。本研究采用温度敏感型凝胶作为布鲁氏菌活疫苗(S2株)的赋型剂,在黏膜免疫部位完成液态到凝胶态的相转变,使得疫苗菌能被凝胶固定于免疫部位,从而降低疫苗流出免疫部位的风险。本实验利用星点设计方法合成13个凝胶配方,再由相变温度的三维效应面和等高线图挑选出4个备选配方,最后通过微流变仪对配方理化性质进行测定,选出空白温敏凝胶的最优配方。将布鲁氏菌病活疫苗S2与空白温敏凝胶按1:9配比混合,制备布鲁氏菌病温敏凝胶活疫苗(S2株)并使用环境扫描电镜对该温敏凝胶活疫苗进行表征分析,再利用以下方法对该温敏凝胶活疫苗不同黏膜免疫效果进行评价。首先测定S2凝胶活疫苗免疫小鼠的最小免疫剂量,使用4种黏膜免疫途径(阴道灌注、点眼、口服、直肠灌注)免疫小鼠,比较S2温敏凝胶活疫苗与S2常规疫苗的体表排菌量以及黏膜免疫与注射免疫的抗体水平变化;然后采用OIE推荐方法,通过攻毒保护试验测定S2凝胶活疫苗4种黏膜免疫途径及S2常规疫苗注射免疫途径对小鼠的免疫效果;最后利用小鼠模型试验中免疫效果较好的黏膜途径免疫羊,测定S2凝胶活疫苗对羊的最小免疫剂量;并比较不同黏膜途径(口服、阴道)的免疫安全性、细胞免疫水平、体液免疫水平。通过上述方法筛选出S2凝胶活疫苗的空白温敏凝胶最佳处方,质量分数为泊洛沙姆407(P407):22.04%、泊洛沙姆188(P188):2.81%;与布鲁氏菌活疫苗按一定配比混合制备出布病温敏凝胶活疫苗S2;电镜扫描图显示研制的布鲁氏菌病温敏凝胶活疫苗(S2株)能够充分承载疫苗菌,并便于疫苗菌的释放。S2凝胶活疫苗对小鼠的最小免疫剂量为100×10~8CFU对小鼠的免疫部位排菌量测定发现S2凝胶活疫苗排菌量只有常规疫苗的0～30%;从小鼠黏膜免疫方式比较发现,阴道灌注排菌量最小(低于100 CFU),排菌时间最短(1 d以内),眼部滴注与直肠灌注次之,而口服排菌量最多(1210 CFU/只),结果表明与常规疫苗相比,凝胶活疫苗可显著减少排菌,且阴道免疫的排菌量最小。对不同黏膜途径抗体水平比较发现黏膜免疫抗体比注射免疫低25～80%,并且在免疫后45 d左右微量试管凝集试验结果(MSAT)即降至1:50以下或接近1:50,下降速度显著快于注射免疫,而且在免疫后90 d,直肠、点眼、口服3种免疫途径抗体水平低于阳性判定标准,结果表明黏膜免疫比注射免疫的抗体持续时间短,黏膜免疫一定程度上利于鉴别诊断。通过攻毒试验测定免疫组的单位保护指数(对照出菌指数-免疫出菌指数),在对照组小鼠的出菌指数为6.47时,免疫组的单位保护指数如下:S2常规疫苗注射免疫是4.08,S2凝胶活疫苗阴道免疫是3.89、点眼免疫是3.41、口服免疫是3.32、直肠免疫是3.25,结果表明4种黏膜免疫途径都显示了良好的保护作用。其中,阴道灌注的免疫保护效果更接近传统的注射免疫,点眼免疫次之。根据小鼠模型对布病温敏凝胶疫苗评价结果,选择阴道灌注和点眼免疫两种方式免疫羊,测得布病温敏凝胶活疫苗S2株对羊最小免疫剂量为500×10~8CFU/只;比较羊免疫部位排菌量发现整体上凝胶疫苗组点眼和阴道灌注的免疫排菌量(15CFU/只、11CFU/只)低于常规剂型疫苗组排菌量(982CFU/只),结果表明相比常规疫苗,凝胶活疫苗在黏膜免疫后可显著减少排菌量。外周血淋巴细胞因子测定发现免疫和攻毒后细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α有明显变化趋势,而IL-12、IL-4、IL-8变化不明显,结果表明IFN-γ、TNF-α、IL-2等因子在抵抗布鲁氏菌感染过程中起重要作用。测定布病温敏凝胶活疫苗S2对羊攻毒保护试验,发现点眼免疫组和阴道免疫组的保护率均能达到80%以上,且单位保护指数分别为2.19和2.42,结果表明两种免疫方式的保护效果相比,阴道免疫的保护力更高一些。组织病理学检查发现攻毒对照组出现明显的病理组织学变化,而免疫组未引起明显的病理组织学变化。结果显示布病温敏凝胶活疫苗S2具有良好的保护作用,引起的病理组织学变化较小。本研究成功制备布病温敏凝胶活疫苗S2,通过小鼠和羊的实验动物模型对布病温敏凝胶活疫苗S2不同途径免疫效果评价发现黏膜免疫具有良好的免疫保护力而且阴道免疫效果最好,同时证实黏膜免疫抗体持续时间短有利于鉴别诊断的优点。