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第一部分武汉协和医院肺部感染来源产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌分子流行病学特征目的了解来源于肺部感染病人产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离株ESBLs基因流行情况,确定其基因亚型,基因背景及菌株特征,探讨产超广谱β-内酰胺酶细菌在我院肺部感染病人分布情况、耐药及传播机制,为临床医师用药及院内感染的控制提供依据。方法收集2015年11月-2016年6月来自华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科确证产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌及肺炎克雷伯杆菌分离菌株263株,剔除不合格标本,最终符合要求的菌株59株。用血琼脂培养基进行细菌培养,以药敏纸片法确证ESBL表型,以聚合酶链反应(PCR)法及测序检测CTX-M、SHV、TEM基因,PCR产物进行测序并确定其基因亚型,同时测定ESBL基因上游序列;以细菌基因组重复序列(Rep-PCR)、多位点序列分型(MLST)法检测细菌间的同源性。结果本院肺部感染产ESBLs大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌检出率达22.43%,产ESBLs菌对三代、四代头孢、氨曲南、喹诺酮类抗生素耐药率高于60%,对阿米卡星、亚胺培南、美罗培南敏感率高于90%。在59份标本中,分离出31株大肠埃希氏菌,其中20株CTX-M基因阳性(占64.51%,分别为CTX-M-3、-14、-27),17株SHV基因阳性(54.84%,分别为SHV-12、-28、-77、81),3株TEM基因阳性(占9.68%,分别为TEM-1),1株菌同时携带SHV-77、-81,1株含有CTX-M、SHV、TEM三种基因阳性(3.23%)。在分离的28株肺炎克雷伯菌中,21株CTX-M基因阳性(占75.00%,分别为CTX-M-3、-14、-27、-65),23株SHV基因阳性(82.14%,分别为SHV-1、-2、-11、-12、-28、-77、-78、-119),16株TEM基因阳性(57.14%,分别为TEM-1、-104、-135);其中7株同时CTX-M、SHV、TEM三种基因阳性(25.00%)。MLST分型结果显示致病力、强耐药性及传播力强的的超级细菌ST131型大肠杆菌以及高毒力、携带多种耐药质粒高致病性的ST11型肺炎克雷伯杆菌在我院肺部感染患者中流行,值得我们高度警惕。此外还检测出4株耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯杆菌,均携带有NDM型基因。上游调控序列检测发现,CTX-M型基因上游序列ISEcp1、SHV型基因上游序列IS26参与ESBL传播及促进酶的表达。结论1)我院肺部感染产ESBLs大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌检出率高,以呼吸机相关性肺炎占主要,主要集中在外科、重症医学科。2)产ESBLs大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌总体耐药率高,特别是对三、四代头孢、氨曲南、喹诺酮类抗生素耐药率高,虽存在耐碳青霉烯抗生素肺炎克雷伯杆菌,但总体对碳青霉烯类抗生素敏感。此外,对阿米卡星、哌拉西林他唑巴坦敏感度高,可作为替代或者联合用药。3)CTX-M型是我院产ESBLs菌株主要类型,其中以CTX-M-14占比最高。大肠杆菌以CTX-M型为主,肺炎克雷伯杆菌以SHV基因型为主。多基因携带情况多见。4)致病力、强耐药性及传播力强的的超级细菌ST131型大肠杆菌以及高毒力、携带多种耐药质粒高致病性的ST11型肺炎克雷伯杆菌在我院肺部感染患者中流行,值得我们高度警惕。5)本实验只发现有肺炎克雷伯杆菌同时携带产碳青霉烯酶和超广谱β-内酰胺酶耐药基因,其携带的碳青霉烯酶基因包括NDM基因。6)ISEcp1和IS26分别作为CTX-M型、SHV型ESBLs基因上游序列,参与了CTX-M型、SHV型传播,且参与了促进了耐药基因的表达,是ESBL广泛流行的重要原因。第二部分武汉协和医院泛耐药铜绿假单胞菌分子流行病学特征目的:调查研究我院泛耐药铜绿假单胞菌流行情况及耐药机制。方法:收集2016.1-2017.6武汉协和医院仅对多粘菌素敏感的泛耐药铜绿假单胞菌菌株,REP-PCR及MLST分析菌株同源性关系。PCR扩增检测产碳青霉烯酶基因、超广谱β-内酰胺酶基因、氨基糖苷钝化酶基因以及喹诺酮类耐药基因。结果:总共分离得到非重复816株铜绿假单胞菌,其中仅对多粘菌素敏感的菌株7株。经过MLST分型,7株菌共发现有6种类型,其中有两株同属于一个类型,ST274。两株为新类型,即ST2546、ST3001。耐药基因检测发现,7株铜绿假单胞菌均含有多种耐药基因。结论:1、我院仅对多粘菌素敏感的泛耐药铜绿假单胞菌检出率低于全国水平。从科室分布来看,内科系统检出率高于外科系统,其中以呼吸科、重症医学科为主。从标本类型来看,痰、胆汁明显多于血、尿标本。仅对多粘菌素敏感的泛耐药铜绿假单胞菌引起肺部感染、胆系特别是对有胆管支架植入术感染在我院仍不容乐观。2、从已有的数据来看,仅对多粘菌素敏感的泛耐药铜绿假单胞菌均有多基因携带情况,其中喹诺酮类耐药基因兼具染色体和质粒介导的多种类型,机制颇为复杂。3、ST274型铜绿假单胞菌在我院已经存在水平传播,该型铜绿假单胞菌易于形成突变系,再加上泛耐药的特性,给我们控制该菌株引起的感染带来了极大的挑战。第三部分产ESBLs细菌异质性耐药机制初步研究目的既往对于细菌的研究都是基于群体而忽视了个体间的差异,而实际上经过抗生素筛选后,单克隆来源的细菌间总有一小部分生存下来,这一小部分细菌在耐药性方面与其他有显著不同,本研究在第一部分的基础上,拟研究以单个细菌为对象,初步探究这种耐药性差异机制,为深入了解细菌在抗生素压力环境下的生存机制提供基础。方法前期已构建好含绿色荧光蛋白(GFP)与β-内酰胺酶基因的表达载体,在荧光显微镜下检测β内酰胺酶调控序列介导下GFP在单个细胞中的表达情况。通过流式分选分选经过过夜培养后的高低表达GFP的两组细菌,然后在流式分选及检测下分析高低亚群单克隆细胞间耐药水平的差异。同时检测药敏值差异。结果高低表达亚群细菌流式检测分析有明显差异,高表达组的细菌荧光强度高,细菌结构更复杂,生长速率更慢,耐药性高。低荧光蛋白表达亚群荧光强度低,生长速率快,耐药性低。结论1、单克隆来源的大肠埃希菌菌株间存在耐药水平的显著差异2、这种耐药水平的差异可能于某种物质调控细菌生长速率有关。