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【研究背景】非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)是淋巴组织常见的恶性肿瘤。其发病率占所有恶性肿瘤的第12位,但死亡率却位居第10位。按照细胞来源,可将NHL分为:B-NHL、T-NHL、NK/T-NHL。弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是NHL中最常见的类型,约占NHL的30%-40%。DLBCL是一类异质性淋巴瘤,其临床表现及病理类型复杂多样,肿瘤生长迅速,具有明显的侵袭性。micro RNA(mi RNA)是一类由内源基因编码的长度约为21-25个核苷酸的非蛋白编码单链RNA分子,在物种之间具有高保守性。mi RNA通常对一个或多个m RNA起作用,并通过翻译水平的抑制或破坏m RNAs而达到调控的目的。现在已知mi RNA参与几乎所有的生命活动过程,如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、代谢、组织发育等过程的调控,而且有研究表明,mi RNA在肿瘤的发生发展过程中起着癌基因或者抑癌基因的作用。因此,mi RNA可以作为早期诊断、判断预后的指标,也可作为一些疾病的治疗靶点。近年有研究表明淋巴瘤常见明显的mi RNA的表达失调。Roehle等人已发现mi R-150、mi R-17-5p、mi R-145及mi R-328在DLBCL中特异性表达。然而,mi RNA在DLBCL的发病机制中的作用尚未完全阐明。因此,我们对大理地区收集到的部分DLBCL标本进行mi RNA表达谱芯片检测及相关研究。【目的】本研究利用mi RNA表达谱芯片比较DLBCL和淋巴结反应性增生组织中mi RNA的差异表达,对差异表达明显的mi RNA进行靶基因预测和功能分析,进而从分子水平探讨DLBCL的发病机制,为寻找鉴定该病的诊断、预后分子标志物和治疗靶点奠定理论基础。【材料和方法】收集大理学院附属医院2012年03月-2013年02月手术切除或活检DLBCL石蜡包埋标本共10例作为实验组,选择同期8例淋巴结反应性增生作为对照组。通过micro RNA芯片技术和生物信息学方法进行差异性micro RNA及靶基因的预测。具体步骤包括:1、mi RNA芯片:使用的是第七代mi RCURYTMLNA杂交芯片(v.18.0)。2、通过使用TRIzol(Invitrogen)and mi RNeasy mini kit(QIAGEN)试剂盒提供的方法提取总RNA。并通过Nano Drop分光光度计(ND-1000,Nano Drop Technologies)进行RNA浓度和纯度的测定,通过琼脂糖凝胶电泳确定RNA的完整性。3.mi RNA标记:使用mi RCURY?Hy3?/Hy5?Power labeling kit(Exiqon,Vedbaek,Denmark)试剂盒并按照其标明的方法对mi RNA进行标记。每个样本取1μg总RNA,在3’末端进行Hy3TM荧光标记。4.mi RNA阵列杂交:经过Hy3TM标记后的样本在mi RCURYTM LNA Array(v.18.0)(Exiqon)下进行阵列分析。然后,通过Axon Gene Pix 4000B microarray scanner(Axon Instruments,Foster City,CA)扫描芯片。5、数据分析:扫描得到的图像输入Gene Pix Pro6.0软件(Axon)进行图像的提取以及数据分析。通过MEV软件(v4.6,TIGR)进行分层聚类。6、靶基因预测:采用mirbase,miranda和targetscan三个数据库对目的 micro RNA进行靶基因预测。并进一步通过Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库对靶基因进行功能分析。【结果】1、差异表达micro RNA筛选:与反应性增生淋巴结组织相比,弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中共59个mi RNA表达上调,67个mi RNA表达下调。2、靶基因预测结果:三个数据库共同预测出的下调micro RNA的靶基因有67个,上调micro RNA的靶基因有394个;两个数据库预测出的下调micro RNA的靶基因有1042个,上调micro RNA的靶基因有3500个。3、肿瘤相关靶基因预测:通过对差异表达micro RNA的靶基因进行GO、Pathway分析,并进行文献检索,确定了3个与肿瘤相关的micro RNA以及4个与肿瘤相关的靶基因。3个目的micro RNA为:hsa-mi R-92a-3p、hsa-mi R-17-5p、hsa-mi R-155-3p,在DLBCL中均表达上调。与之相关的4个靶基因分别是:ITGA5(hsa-mi R-92a-3p)、CDKN1C(hsa-mi R-92a-3p)、ITGB8(hsa-mi R-17-5p)、TP53INP1(hsa-mi R-155-3p)。【结论】1、hsa-mi R-92a-3p、hsa-mi R-17-5p、hsa-mi R-155-3p在DLBCL组织中表达上调,可能与DLBCL的发生发展、迁移及侵袭有关。2、预测的与肿瘤相关的4个有代表性的靶基因分别是:ITGA5(hsa-mi R-92a-3p)、CDKN1C(hsa-mi R-92a-3p)、ITGB8(hsa-mi R-17-5p)、TP53INP1(hsa-mi R-155-3p)。3、has-mi R-92a-3p、has-mi R-17-5p可能在基因表达调控、促进肿瘤进展等方面发挥协同作用。4、has-mi R-92a-3p与hsa-mi R-155-3p、has-mi R-17-5p与hsa-mi R-155-3p则无共同调控的靶基因。5、hsa-mi R-92a-3p、hsa-mi R-17-5p、hsa-mi R-155-3p可能通过作用于ITGA5(hsa-mi R-92a-3p)、CDKN1C(hsa-mi R-92a-3p)、ITGB8(hsa-mi R-17-5p)、TP53INP1(hsa-mi R-155-3p)等靶基因发挥其癌基因作用。