【摘 要】
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第一部分GATA4在髓核细胞中的表达变化规律目的观察不同类型衰老髓核细胞中GATA4表达情况,探索髓核细胞衰老过程中GATA4的表达的变化规律。方法采用针刺法构建SD大鼠椎间盘退变（IVDD）模型;采用酸性培养基刺激髓核细胞构建诱导过早衰老模型。获取SD大鼠8周、25周、50周以及8周穿刺诱导椎间盘退变,共四个时间点的椎间盘正中冠状面切片。HE染色观察细胞成分及形态学演变,分别提取正常组8周与退变
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（81702203、81871810）；
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第一部分GATA4在髓核细胞中的表达变化规律目的观察不同类型衰老髓核细胞中GATA4表达情况,探索髓核细胞衰老过程中GATA4的表达的变化规律。方法采用针刺法构建SD大鼠椎间盘退变（IVDD）模型;采用酸性培养基刺激髓核细胞构建诱导过早衰老模型。获取SD大鼠8周、25周、50周以及8周穿刺诱导椎间盘退变,共四个时间点的椎间盘正中冠状面切片。HE染色观察细胞成分及形态学演变,分别提取正常组8周与退变髓核组织（8周穿刺退变、25周、50周）以及正常对照组和酸性环境培养的髓核细胞的m RNA和蛋白,采用实时荧光定量聚合酶链反应（q RT-PCR）和蛋白质印迹实验（Western blot）来进行正常及退变椎间盘髓核组织中GATA4的表达情况的检测。结果在SD大鼠的自然衰老和诱导的应激过早衰老过程中,GATA4的表达明显增加。在动物模型中,与正常8周大鼠相比,25周、50周大鼠和8周针刺退变模型的大鼠髓核组织中GATA4的表达明显增高（p＜0.05）,8周大鼠髓核组织中GATA4的表达较少;在细胞模型中,与正常对照组相比,酸性环境诱导的过早衰老的髓核细胞中GATA4的表达明显升高（p＜0.05）。结论对比8周、25周和50周大鼠髓核组织中GATA4的表达情况发现,随着大鼠周龄的增加,GATA4的表达存在逐渐增加的趋势。采用针刺法构建的IVDD模型和酸应激诱导的过早衰老模型中,衰老髓核细胞中的GATA4分子的表达比较正常髓核组织明显升高（p＜0.05）。第二部分GATA4对酸诱导的髓核细胞衰老和SASP的影响及作用机制目的探索上调或者下调GATA4的表达对髓核细胞衰老和SASP的影响方法在体外环境中对SD大鼠髓核细胞进行分离、培养以及鉴定;将实验进行分组,各组为:正常对照组、酸干预组和衰老组（连续传代至第24代）。使用CCK-8法检测细胞增殖生长活力、衰老相关半乳糖苷酶（Senescence-Associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）染色法检测阳性染色细胞比例、RT-PCR、WB、流式细胞周期检测细胞停留在各相的比例,从基因、蛋白以及细胞功能水平评估髓核细胞衰老情况及GATA4的变化;为进一步研究GATA4与细胞衰老之间的关系,我们下调了GATA4的基因表达。实验进一步分组:正常对照组、酸干预组、酸干预GATA4基因沉默组、酸干预GATA4基因沉默对照组。应用上述实验方法检测各实验组髓核细胞衰老相关表型（细胞增殖活力、SA-β-gal、细胞周期、p53）、GATA4、SASP及细胞外基质（Aggrecan、Collagen II）的合成分泌能力的变化,同时观察NF-κB通路相关分子表达情况。以明确GATA4在酸诱导的髓核细胞衰老过程中的作用机制。结果与正常对照组相比,酸性环境促进了髓核细胞衰老并将髓核细胞中GATA4的表达上调（p＜0.05）;然而,通过对髓核细胞的GATA4基因沉默,在酸性环境中培养的细胞β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例、p53、SASP的表达、细胞周期停滞均明显减少（p＜0.05）,同时Aggrecan、Collagen II的表达得到了改善。与对照组相比,GATA4基因沉默组的p-NF-κB（p-p65）表达显著降低。结论GATA4的表达与髓核细胞的衰老存在一定的联系,随着髓核细胞老化,GATA4的表达逐渐增加;酸性环境可以诱导髓核细胞衰老,GATA4的表达与酸性环境的程度存在一定程度联系,在一定范围内,p H越低,GATA4表达越高。GATA4在髓核细胞衰老过程中发挥促进的作用,并且可通过抑制GATA4影响NF-κB信号通路的活化,减缓髓核细胞衰老过程。
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