米托蒽醌(mitoxantrone)是一种蒽环类抗生素,为细胞周期非特异性广谱抗癌药,在临床应用中存在某些较严重的不良反应,如心脏毒性。脂质体作为抗肿瘤药物的载体,具有靶向、减毒、增效的优良特性,但是由于米托蒽醌的释放不易控制,限制了其脂质体制剂的开发。热敏脂质体通常用相变温度稍高于体温的磷脂来包封药物,体内给药后,利用局部加热的方法触发脂质体携带的药物迅速释放于加热部位而产生靶向作用。热敏脂质体加入长循环材料,在脂质体表面形成亲水层和空间位阻,可以避免网状内皮系统(RES)的吞噬,降低脂质体的血液清除率,从而延长脂质体在循环系统的滞留时间,增加脂质体的靶向效果。目的:本研究采用米托蒽醌为模型药物,制备长循环热敏脂质体。通过配合热疗增加脂质体药物在肿瘤区域的富集并触发米托蒽醌迅速释放,发挥药效,从而达到增加靶向性、提高治疗指数的目的。方法:在处方前研究的基础上初步确定米托蒽醌长循环热敏脂质体的制备方法:首先制备以柠檬酸为内相的空白脂质体,然后透析置换外相溶液形成跨膜pH梯度,最后将药物与空白脂质体溶液混合孵育,得到米托蒽醌长循环热敏脂质体。以包封率和含量为指标,通过单因素试验优化脂质体的制备工艺,考察不同外相溶液、孵育温度、孵育时间、药物与磷脂质量比等对脂质体的影响,最终确定米托蒽醌脂质体的最佳处方。对制备得到的米托蒽醌长循环热敏脂质体进行了质量研究,主要包括外观、pH值、渗透压、粒径分布、包封率和含量等指标的测定。通过体外释放实验和细胞实验验证脂质体的热敏特性,并且进行了五个月长期稳定性试验。选用BDFl小鼠作为实验动物,采用液相色谱-串联质谱的方法分别对米托蒽醌溶液和米托蒽醌长循环热敏脂质体进行体内药代动力学研究。以BDFl小鼠为实验动物,考察米托蒽醌长循环热敏脂质体的毒性。以接种了前列腺癌RM-1细胞的BDF1小鼠为动物模型,对米托蒽醌长循环热敏脂质体的药效学进行初步研究,对比了米托蒽醌长循环热敏脂质体配合不同热疗方式与米托蒽醌游离药对前列腺癌的治疗效果。考察大鼠重复注射米托蒽醌长循环热敏脂质体是否会产生加快血液清除(accelerated blood clearance,ABC)现象。以Wistar大鼠为实验动物,采用液相色谱-串联质谱的方法测定动物血浆中药物的含量,考察了米托蒽醌长循环热敏脂质体在重复给药后的药动学变化,并对血样中的抗PEG的IgM抗体进行ELISA检测,以揭示其产生药动学变化的原因。以荷RM-1瘤的BDF1小鼠为实验动物,简单研究了米托蒽醌热敏脂质体配合不同热疗方式后米托蒽醌在肝脏和肿瘤部位的药物分布情况。结果:通过实验确定最佳处方为:三种磷脂DPPC、MSPC、mPEG2000-DSPE的摩尔比为90:10:4,药物与磷脂的比例为1:10(w/w),内相为0.3 mol/L柠檬酸溶液(pH=4.0),以20 mmol/L组氨酸为透析液,孵育温度35℃,孵育时间45 min。药物包封率高,重现性良好。所制备脂质体从体外释放和细胞水平来分析,均显示了良好的热敏特性。体外释放实验中米托蒽醌长循环热敏脂质体在37℃时1 h药物释放不足10%,而41℃时1h几乎可以释放全部药物。细胞实验中,热敏脂质体37℃处理45 min后,对细胞抑制不明显,证明药物释放很少;在41℃时,处理10 min和45 min时均显示了良好的抑制作用,证明药物在此温度释放很快。质量研究结果显示:三批米托蒽醌脂质体的平均检测结果如下:pH值为6.53;渗透压为309 mOsmol/Kg;平均粒径为100.1 nm;包封率为98.41%;稳定性结果显示:脂质体混悬液在4-8℃条件下存放两个月,包封率、pH、粒度、含量均无明显变化,但随储存时间延长脂质体的热敏特性消失。实验证明热敏特性的消失是因为米托蒽醌与内水相的柠檬酸溶液存在缓慢的沉积过程。药动学试验表明:米托蒽醌游离药物溶液和脂质体的血浆药代动力学存在明显差异,米托蒽醌长循环热敏脂质体组和游离药物组的AUC、消除半衰期和清除率分别为 5.332 μg·h·ml-1、1.294 h、0.719 ml·h-1·g-1 和 0.583μg·h·ml-1、0.412h、6.691ml·h-1·g-1,说明将米托蒽醌制成长循环热敏脂质体可以增加药物在血液中的循环时间。毒性、药效学试验结果表明:米托蒽醌游离药和长循环热敏脂质体的MTD均小于10.2 mg/kg,将米托蒽醌制成热敏脂质体并未明显降低其毒性;药效学实验中米托蒽醌游离药与长循环热敏脂质体(提前开始热疗)对肿瘤的抑制率分别为27.9%和86.1%。因此米托蒽醌长循环热敏脂质体可以通过增加抗肿瘤效果来提高药物的治疗指数。ABC现象的研究结果表明:第一次给药后AUC为1.905±0.121μg·h·mL-1,CL为1251.291±229.132 mL·h-1.kg-1;第二次给药后 AUC 为0.581±0.082μg·mL-1,CL为 3567.959±374.738ml·h-1·kg-1;体内抗体检测证明在第一次静脉给予米托蒽醌长循环热敏脂质体后第七天血中抗PEG的IgM抗体水平较高,此时第二次给药,该抗体则可以与所给脂质体药物结合,加快药物清除。结合药动学和动物体内抗体水平变化证明大鼠重复注射米托蒽醌长循环热敏脂质体诱发了 ABC现象。组织分布的结果表明,给药后不同时间热疗对药物的分布存在影响,给药后立刻开始热疗对肿瘤部位药物的增加更为明显。结论:以米托蒽醌为模型药物,制备长循环热敏脂质体,该脂质体包封率高、热敏特性显著、配合热疗可以显著增加药物的治疗效果,从而提高治疗指数。在研究过程中,发现透析液的渗透压会对长循环热敏脂质体药物的装载造成影响,并用模拟实验说明了脂质体在长期储存后热敏特性消失的原因;结合药动学和动物体内抗体水平变化证明大鼠重复注射米托蒽醌长循环热敏脂质体能够诱发ABC现象。