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背景和目的：联合应用原位胶原酶灌注、离体消化和密度梯度离心是分离Kupffer细胞的常用方法,然而传统的两层密度梯度离心法不能有效去除非活性细胞成分,以致形成非特异性染色影响流式细胞仪检测结果。本研究的目的是根据不同肝脏非实质细胞的密度设计多层密度梯度离心法以制备更适用于流式细胞仪检测的肝脏非实质细胞标本。材料和方法:在通过原位胶原酶灌注和离体消化分离肝脏细胞后,应用质量体积浓度分别为7.2%、11.2%、13.2%及18%的OptiPrepTM密度梯度液分离肝脏非实质细胞,利用流式细胞技术检测离心后各密度分层界面所得细胞群中Kupffer细胞比例及7-AAD荧光染色阳性的非活性Kupffer田胞比例。选择活性Kupffer细胞比例最高的细胞群与经典两层密度梯度离心法(11.5%及17.6%OptiPrepTM密度梯度液)比较,观察两种方法所得样本中upffer田胞得率、F4/80抗原平均荧光强度及样本非特异性染色比例的差异。结果:离心后沿密度梯度共形成四组可见的细胞群,其中位于7.2%／11.2%OptiPrepTM密度梯度液分界层面的细胞群Kupffer细胞占非淋巴性肝非实质细胞比例及活性Kupffer细胞比例最高(P<0.05)。与两层密度梯度离心法相比,四层密度梯度离心法所得样本中Kupffer得率更高、PE耦联F4/80平均荧光强度更高,同时样本非特异性染色比例更低(P<0.05)结论:改良的四层密度梯度离心法可以有效提高非淋巴性肝脏非实质细胞及Kupffer细胞的细胞得率,减少流式细胞分析中非活性成分引起的非特异性染色。背景和目的：经典理论认为Kupffer细胞依靠单核细胞介导来源于骨髓造血干细胞,而近期研究提出Kupffer细胞起源于胚胎卵黄囊前体细胞,且在成年期长期依靠自身更新维持细胞数量,但这两种理论均无法解释绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)嵌合小鼠体内骨髓来源Kupffer田胞与原位Kupffer细胞并存的现象。本研究的目的为利用GFP标记骨髓来源细胞,尤其是造血干细胞以追踪其在小鼠Kupffer细胞受损时对维持正常Kupffer田胞数量的作用。材料和方法：建立肝脏屏蔽照射GFP骨髓嵌合小鼠模型,利用流式细胞分析、荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)技术及肝脏免疫荧光染色分别检测在稳态、放射线照射、氯膦酸盐脂质体清除Kupffer细胞以及四氯化碳诱导的急慢性肝脏炎症时肝脏Kupffer细胞、骨髓造血干／前体细胞及血液单核细胞的GFP表达情况通过高通量细胞表面标志物筛选技术鉴定不同来源的巨噬细胞,并应用过继性细胞回输技术对所得结果行进一步验证。结果：肝脏屏蔽照射骨髓嵌合小鼠模型在骨髓移植后40周内肝脏内仅检测出极少量GFP阳性Kupffer细胞,且肝脏原有Kupffer细胞数量较照射前无明显变化。当受到放射线损伤时,肝内原有GFP阴性Kupffer田胞数量明显减少,且在骨髓移植后40周内未发现明显增殖迹象,而损失的Kupffer细胞由骨髓来源的驻留型GFP阳性巨噬细胞所补充。氯膦酸盐脂质体清除Kupffer细胞后及反复注射四氯化碳诱导肝脏慢性炎症时也观察到了相似的现象。但在单次四氯化碳诱导肝脏急性炎症模型中,骨髓来源的巨噬细胞仅在肝脏内短暂停留。这两种骨髓来源巨噬细胞具有不同的基因表达及细胞表面标志物,与表达单核细胞标志物的迁移型巨噬细胞不同,驻留型巨噬细胞表达造血干细胞表面标志物、可在应用造血干细胞动员剂时增多。同时用氯膦酸盐脂质体清除Kupffer细胞后,移植造血干细胞而非单核细胞可补充Kupffer细胞数量。结论：小鼠肝脏Kupffer细胞池的维持在稳态时不依赖骨髓；而当肝脏受损且Kupffer田胞数量减少时,骨髓造血干细胞可通过单核细胞以外的途径补充损失的Kupffer细胞。