动物卵子发生是雌性个体产生成熟卵子的过程。有性生殖的雌雄个体交配产生受精卵,随后进行胚胎发生,受精卵的大部分细胞质来自于卵子,其中含有支持早期胚胎发生的许多重要成分,所以卵子的质量对于胚胎发育至关重要,卵子发生异常往往会导致雌性个体不育。因此,对卵子发生的调控机制的研究是十分必要的。Sox3是Sox基因家族的成员之一,在小鼠中的研究表明Sox3对卵母细胞发育和雄鼠睾丸分化及精子发生至关重要。斑马鱼Sox3在卵巢的颗粒细胞和鞘膜细胞等体细胞中表达,其在斑马鱼卵子发生过程中起作用。本实验室前期的转录组分析显示,Sox3在尼罗罗非鱼（Oreochromisniloticus）卵巢中高表达。而关于Sox3在尼罗罗非鱼卵巢中的表达模式以及它在卵巢发育和卵子发生中的功能以及分子机制还有待研究。在本研究中,我们通过转录组数据分析、Real-time PCR实验验证和荧光原位杂交等实验探究了Sox3在尼罗罗非鱼性腺组织中的时期表达和细胞定位。本研究还制备了尼罗罗非鱼anti-Sox3抗体,利用该抗体通过免疫荧光实验检测了Sox3蛋白在卵巢中的细胞定位。接着我们应用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了尼罗罗非鱼Sox3纯合突变系,进一步通过形态学和组织学分析以及脂质染色实验探究了Sox3缺失后对尼罗罗非鱼卵巢发育和卵子发生的影响,通过转录组测序分析和ChIP-seq实验等初步探究了 Sox3在尼罗罗非鱼卵子发生中的作用机制。本研究获得的主要结果如下:1.尼罗罗非鱼Sox3的表达、anti-Sox3抗体制备及检测（1）Sox3在不同发育阶段尼罗罗非鱼性腺中的表达变化及细胞定位本研究通过对各发育时期的尼罗罗非鱼性腺的转录组数据分析和Real-time PCR实验验证,探究了 Sox3在不同发育阶段尼罗罗非鱼性腺中的表达变化,结果显示Sox3在雌鱼性腺的表达在30 dah时开始升高,随着性腺的发育,到90 dah时Sox3的表达进一步升高,到180 dah时,Sox3在卵巢的表达达到最高。而Sox3仅在30 dah的雄鱼性腺中有一定的表达,在其他时期基本不表达。我们利用荧光原位杂交对SSox3在不同发育时期的尼罗罗非鱼雌雄性腺中的表达进行分析,结果显示Sox3在90 dah的尼罗罗非鱼卵巢的Ⅰ、Ⅱ时相卵母细胞中表达,在180 dah的尼罗罗非鱼卵巢的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ时相卵母细胞中表达。（2）尼罗罗非鱼anti-Sox3抗体制备及检测本研究将Sox3在大肠杆菌中进行原核表达,并对表达的蛋白进行了纯化,最后制备了 anti-Sox3抗体,并通过Western blot实验检测了该抗体,结果表明该抗体能够识别尼罗罗非鱼Sox3蛋白。接着我们使用anti-Sox3抗体对尼罗罗非鱼卵巢切片进行了免疫荧光实验,结果显示其细胞定位和荧光原位杂交一致,Sox3蛋白在90 dah的尼罗罗非鱼卵巢的Ⅰ、Ⅱ时相卵母细胞中表达,在180 dah的尼罗罗非鱼卵巢的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ时相卵母细胞中表达。以上的结果暗示Sox3可能参与调控尼罗罗非鱼卵子发生。2.Sox3在尼罗罗非鱼卵巢发育和卵子发生中的功能本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了尼罗罗非鱼Sox3纯合突变系,接着对90 dah、120 dah和180 dah的Sox3+/+、Sox3+/-和Sox3-/-雌鱼卵巢进行了形态学和组织学分析,并对雌鱼的性腺成熟系数（GSI）和不同类型的生殖细胞数量进行了统计分析。研究结果显示,在90 dah和120 dah时Sox3+/+、Sox3+/-和Sox3-/-雌鱼卵巢在解剖学和组织学水平均无显著差异。而在180dah时,与Sox3+/+雌鱼相比,Sox3+/和Sox3-/-雌鱼的GSI显著减小,卵巢中的Ⅲ时相（正在进行卵黄发生）和Ⅳ时相（充满卵黄颗粒）卵母细胞数目显著减少。利用BODIPY染中性脂质观察卵巢的脂滴积累情况,对BODIPY阳性细胞统计发现,与Sox3+/+雌鱼卵巢相比,Sox3-/-雌鱼卵巢中含有中性脂质的卵母细胞数目显著减少。以上结果说明Sox3突变导致卵巢的卵母细胞卵黄发生减少,中性脂质积累受阻。3.Sox3在尼罗罗非鱼卵子发生中的作用机制（1）Sox3敲除突变对尼罗罗非鱼卵巢转录组的改变本研究基于转录组测序及数据分析,揭示了Sox3缺失后对180 dah的尼罗罗非鱼的卵巢转录组的影响。分别解剖3条180 dah的野生型和Sox3纯合突变雌鱼,取卵巢提取总RNA并开展转录组测序分析。结果显示与对照相比,Sox3纯合突变雌鱼卵巢中有4000个基因表达显著上调,3057个基因表达显著下调;对差异表达基因进行KEGG富集分析显示差异表达的基因富集到了脂肪酸代谢通路、类固醇生成通路和PPAR信号通路等。进一步对差异表达基因进行分析发现,Sox3缺失使一些与卵母细胞卵黄发生和脂质积累相关的基因的表达发生了显著的改变。与卵黄发生相关的基因Fshr和Ctsd的表达显著下调。与脂质积累相关的基因Vldlr的表达显著上调,Lp1、Lpl2、Apoa4a、Apoa4b、Apolipoprotein A-I、Apolipoprotein A-IV、Apoc2、Apoc1、Apoeb、Fabp3、Fabp4a、Fabp7a的表达显著下调。以上结果说明尼罗罗非鱼Sox3缺失会使卵巢中与卵母细胞卵黄发生和脂肪积累相关的一些基因的表达发生改变,进一步导致了卵巢卵母细胞的卵黄发生减少和脂质积累受阻。（2）Sox3纯合突变对尼罗罗非鱼雌鱼血清E2和11-KT水平的影响通过测定血清中的雌、雄激素水平发现,与180 dahSox3+/+雌鱼相比,Sox3-/-雌鱼的血清E2和11-KT水平显著降低。进一步检测发现雌激素合成限速酶基因Cyp19ala的mRNA表达水平显著下调,对Cyp19ala转录起正调控作用的Foxl2的mRNA表达水平也显著下调。这些结果说明尼罗罗非鱼Sox3缺失导致雌鱼血清中的雌、雄激素水平下降,可能进一步影响了卵巢卵母细胞的卵黄发生和脂质积累。（3）尼罗罗非鱼Sox3潜在靶基因的ChIP-seq筛选本研究对90 dah尼罗罗非鱼雌鱼卵巢组织进行了 ChIP-seq分析,以在全基因组水平鉴定筛选Sox3的潜在下游靶基因。利用MACS2软件完成峰检分析,发现ChIP-seq数据中具有12547个Sox3富集的峰。使用ChIPseeker软件统计出peak在各个功能区域上的分布,结果显示有4100个峰位于基因间隔区,3463个峰位于内含子区域,2914个峰位于启动子区域。利用MEME软件对测得的ChIP-seq数据的分析显示,Sox3与尼罗罗非鱼卵巢中潜在靶基因的结合基序主要为C（T/A/G）C（G/T/A）A（C/T/G）G（T/A/C）G（T/A）C（G/A/T）C（T/G/A）A（T/C/G）。通过分析我们发现Sox3的潜在靶基因有Vasa和Vldlrl等,说明Sox3可能能通过调控Vasa和Vldlrl等基因的表达来影响卵巢生殖细胞的发育和脂质的积累,当然还需要进一步的验证。对Sox3潜在靶基因进行的GO功能分类分析显示,这些基因主要参与雌性配子发生,脂肪酸代谢,脂质生物合成,类固醇生成等生物学过程。综上所述,Sox3主要在尼罗罗非鱼雌鱼卵巢的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ时相卵母细胞表达。Sox3纯合突变会导致雌鱼卵巢的Ⅲ、Ⅳ时相卵母细胞数量减少,卵巢卵母细胞的卵黄发生减少,脂质积累受阻。尼罗罗非鱼Sox3缺失会导致雌鱼血清中的雌、雄激素水平下降,从而可能进一步影响了卵巢卵母细胞的卵黄发生和脂质积累;此外Sox3可能能够调控Vasa的表达,影响卵巢生殖细胞的发育,或者通过直接调控与脂质积累相关的基因Vldlr来调控卵巢的脂质积累。本研究有助于丰富完善罗非鱼等动物卵子发生的分子调控机理。